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《第四军医大学》 2017年
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MicroRNA-24在喉鳞状细胞癌中的作用研究

许莉  
【摘要】:【背景】头颈部恶性肿瘤中以喉癌最为常见,其病理类型又以鳞状细胞癌最多,所占比例高达90%[1]。近年来喉鳞状细胞癌(laryngalsquamouscell carcinoma,LSCC)在我国的发病率呈逐年上升趋势。LSCC病因复杂,现有观点认为与吸烟、饮酒、空气污染、乳头状瘤病毒感染等有关。喉部结构隐蔽且复杂,很多LSCC患者发现时已处于相对晚期,导致其长期生存率较低。LSCC的治疗主要应用外科手术切除和保留喉的放化疗,外科手术虽最为有效但常造成大范围的组织缺损和器官损伤,导致功能重建困难或无法修复重建,最终患者不得不承受相应功能遭到破坏甚至完全丧失的后果,严重影响患者的生存质量。放化疗虽然避免了手术切除造成的器官或组织缺损,具有保全结构和功能方面的优势,但也存在许多局部及全身并发症问题,其中最重要的是容易出现放疗和化疗抵抗导致病情得不到有效控制,从而不能延长患者的生存时间。因此寻找新的诊断方法及治疗靶点对提高LSCC诊治率有重要意义。现代医学研究认为肿瘤的发生是一个多基因、多因素参与的复杂过程,分子水平的改变在肿瘤的发生及进展过程中起到了重要调控作用,且这种变化往往是早于临床表现出现之前就已发生。对LSCC发生和进展的分子调节机制进行进一步研究,找寻其中发挥关键作用的分子,一方面能够为LSCC早期诊断和预后判断提供可用的标记分子,另一方面也能够为针对LSCC进行分子靶向干预治疗提供潜在的药物靶点。MicroRNAs(miRNAs)是一组由17-25个核苷酸组成的小非编码RNA,它通过与目标信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’端非翻译区(3'untranslational region,3’-UTR)特异性结合降解转录后产物或抑制翻译过程,与恶性肿瘤的发生发展密切相关,是肿瘤发展与维持过程中的重要因子[2]。多种miRNA被报道能够调节肿瘤细胞的增殖、迁徙、凋亡及放化疗抵抗,且在相关肿瘤的早期诊断、治疗和预后方面具有良好前景,这其中就包括有miR-24,它在肺癌、肝细胞癌及口腔癌等多种实体肿瘤中发挥调节作用,有成为肿瘤标记物的潜力[3][4,5]。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡相关蛋白家族最具活力分子,它通过抑制细胞凋亡促进肿瘤发生发展,目前研究表明它在喉癌中高表达且发挥促癌作用。目前关于miR-24与LSCC的研究较少,有研究报道指出miR-24在LSCC组织中表达低于癌旁组织,提示miR-24可能与LSCC发生发展相关,但是其具体表达模式及作用机制尚不完全清晰,与XIAP是否相关,以及对LSCC的放疗影响目前也未见相关报道。我们前期选择15组LSCC组织和癌旁组织检测miR-24,结果发现miR-24在LSCC组织中低表达,支持了本研究的可行性。为阐述miR-24在LSCC中的作用,在本研究中我们检测了miR-24在LSCC中表达水平并分析了其与患者临床病理特征的相关性;在LSCC细胞系中检测了miR-24对肿瘤细胞的生物学行为影响;对其作用的靶基因进行预测和验证;验证靶基因沉默后LSCC细胞的生物学行为改变;还进一步探索了miR-24对LSCC细胞放疗敏感性的影响及其可能机制,以期为miR-24用于LSCC的诊断、治疗和预后判断提供理论依据。【目的】1.检测人LSCC细胞和组织中miR-24的表达,并分析其表达水平与临床病理特征的相关性。2.检测miR-24对LSCC细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。3.预测miR-24的靶基因并对其进行验证。4.验证沉默靶基因后LSCC细胞的生物学行为改变。5.研究miR-24对LSCC细胞放疗敏感性影响及其可能的发生机制。【方法】1.利用qRT-PCR检测Hep-2细胞、AMC-HN-8细胞与HaCaT细胞中miR-24表达;收集60例LSCC患者的肿瘤组织和配对癌旁组织,之后利用q RT-PCR检测其中miR-24表达并分析其表达水平与临床病理特征之间的相关性。2.利用细胞转染技术构建过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞,同时设置空白对照组和阴性对照组。MTT、克隆形成实验检测Hep-2、AMC-HN-8细胞的增殖和克隆形成变化;划痕实验和Transewell实验对其迁移和侵袭能力进行检测;流式细胞术分析其凋亡变化。3.利用生物信息学技术预测miR-24的靶基因并从中筛选目标靶基因,通过双荧光素酶基因检测系统对靶基因进行验证。Western blotting检测过表达miR-24组和对照组Hep-2、AMC-HN-8细胞中靶基因蛋白表达水平;qRT-PCR、Western blotting分别检测Hep-2、AMC-HN-8细胞和LSCC组织中靶基因表达,并分析LSCC组织中靶基因mRNA与miR-24的相关性。4.利用RNA干扰技术将Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的靶基因沉默,同时设置空白对照组和阴性对照组,Western blotting检测沉默效果。通过MTT、细胞克隆形成实验、流式细胞术对其增殖、凋亡进行检测,验证干扰靶基因后是否产生与上调miR-24相似的作用。5.利用细胞转染技术获得过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞,同时设置对照组。对过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞与对照组细胞分别进行0、2、4、6、8Gy的射线照射,通过Clonogenic survival assay检测接受不同剂量照射后的Hep-2、AMC-HN-8细胞存活率;给予过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞与对照组细胞6Gy射线照射,计算并分析各组细胞的克隆形成数;流式细胞术分析接受6Gy照射后的各组细胞凋亡率;Western blotting检测接受6Gy照射后的各组细胞中cleaved-caspase-3、总caspase-3、cleaved-PARP、总PARP表达。6.利用RNA干扰技术沉默Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的靶基因,设置对照组比对。所有细胞均接受0、2、4、6、8Gy的射线照射,Clonogenic survival assay分析不同剂量照射后Hep-2、AMC-HN-8细胞存活率;沉默组和对照组细胞分别进行6Gy射线照射,流式细胞术观察各组细胞凋亡率。Western blotting检测接受6Gy照射后的各组细胞中cleaved-caspase-3、总caspase-3、cleaved-PARP、总PARP表达。【结果】1.Hep-2细胞、AMC-HN-8细胞与HaCaT细胞相比较miR-24表达下调。2.LSCC组织较癌旁组织中的miR-24表达水平下调,LSCC患者肿瘤组织中miR-24的表达水平与患者的TNM分期(P=0.014)、淋巴结转移(P=0.019)呈现相关,而与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤分型及病理学分级无相关性。3.利用细胞转染技术过表达Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24,qRT-PCR检测结果表明转入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞与空白转入组及未转染阴性对照组相比较miR-24明显升高,空白转入组与未转染阴性对照组无变化,表明过表达miR-24的LSCC细胞系构建成功。4.MTT、克隆形成实验发现过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞与对照组相比较增殖受到抑制,且过表达miR-24组较对照组的克隆形成数少,细胞形状小;划痕实验及Transewell结果表明过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞迁移侵袭能力降低;流式细胞术发现过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞凋亡率升高,以上结果表明过表达miR-24可抑制LSCC细胞增殖、迁移、侵袭,并促进其凋亡。5.利用生物信息学技术预测miR-24的靶基因,从中选中XIAP为目标靶基因,双荧光素酶基因检测系统对XIAP进行验证,结果显示与空白对照组(转入miR-NC)比较miR-24可抑制自然型XIAP 3’UTR报告载体的荧光信号,但是对突变型载体来说无论共转染miR-24还是miR-NC其荧光活性基本无明显改变,表明miR-24能直接与XIAP 3’UTR结合,XIAP是miR-24的下游靶基因。6.Western blotting检测发现过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞与空白对照组比较,XIAP表达明显下调,表明miR-24可负性调控XIAP表达。7.qRT-PCR、Western blotting检测结果显示与正常HaCaT细胞相比较,Hep-2、AMC-HN-8细胞中XIAPmRNA及蛋白表达水平均明显上调;LSCC组织中XIAP表达水平较邻近组织明显上调,对LSCC组织中miR-24表达量与XIAP mRNA表达量进行相关性分析结果表明两者呈负性相关。8.利用基因干扰技术将Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的靶基因XIAP沉默,Western blotting结果显示沉默组较未沉默组的XIAP表达水平明显下降,未沉默组与未干扰对照组相比较无变化,表明干扰成功。9.MTT、细胞克隆形成实验结果表明沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8细胞较未沉默对照组细胞生长受到抑制、克隆数减少;流式细胞术发现沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8细胞凋亡率较对照组高。10.Clonogenic survival assay结果显示:(1)接受不同剂量射线照射(2、4、6、8Gy)的Hep-2、AMC-HN-8细胞(不管是转入miR-24或转入miR-NC)存活率均较未接受照射组低,且在0-8Gy范围内下降程度随剂量增加而增大;(2)与转入miR-NC的对照组相比较,过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞在每个剂量组存活率均降低明显,说明辐射可降低Hep-2、AMC-HN-8细胞存活率,且随剂量增加细胞存活数量越少,过表达miR-24可使细胞死亡进一步增多。11.辐射后克隆形成实验显示:(1)转入miR-24和转入miR-NC的Hep-2、AMC-HN-8细胞接受6Gy照射后克隆形成数均较未接受辐射组少;(2)同一剂量(6Gy)照射后,过表达miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞较空白转入对照组细胞克隆数少,说明辐射可抑制Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖,过表达miR-24可使抑制进一步增强。12.辐射后流式细胞术分析结果显示:(1)接受6Gy射线照射后细胞凋亡率均较未照射组高(转入miR-24或转入miR-NC的Hep-2、AMC-HN-8细胞均如此);(2)转入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞均较空白转入组凋亡率高,说明miR-24可通过增强辐射诱导的凋亡,增加Hep-2、AMC-HN-8细胞放疗敏感性。13.Western blotting分析结果发现:(1)不论有没有过表达miR-24,与相对应未照射组比较,接受6Gy照射的Hep-2、AMC-HN-8细胞cleaved-caspase-3和cleaved-PARP均增多,总caspase-3和总PARP表达均减少;(2)转入miR-24的Hep-2、AMC-HN-8细胞均较空白转入组cleaved-caspase-3和cleaved-PARP增多,且总caspase-3和总PARP表达减少,表明辐射可增加caspase-3活性,过表达miR-24可使caspase-3活性进一步增强,miR-24可通过诱导caspase-3依赖的细胞凋亡增强LSCC细胞的放疗敏感性。14.对沉默XIAP的Hep-2、AMC-HN-8细胞给予与过表达miR-24的细胞同样的射线干预实验,结果表明沉默XIAP同样可以通过增强辐射诱导的caspase-3依赖的细胞凋亡增强Hep-2、AMC-HN-8细胞放疗敏感性。【结论】1.miR-24在LSCC细胞和组织中均低表达,miR-24在组织中的表达水平与患者的TNM临床分期、淋巴结转移密切相关。2.miR-24能抑制LSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力,并促进其凋亡。3.XIAP是miR-24的直接下游靶基因;沉默XIAP能抑制LSCC细胞增殖,并促进其凋亡;LSCC细胞和组织中XIAP在转录水平及蛋白水平均高表达,且在LSCC组织中XIAPmRNA与miR-24负性相关。4.辐射可降低LSCC细胞存活率,抑制其克隆形成,并促进其凋亡。miR-24能通过增加辐射诱导的caspase-3依赖的细胞凋亡增强LSCC细胞放疗敏感性。沉默XIAP可通过与上调miR-24同样机制增强LSCC细胞放疗敏感性。综上所述,miR-24在LSCC中低表达,miR-24的表达水平与LSCC患者的疾病进展密切相关。miR-24能抑制LSCC细胞增殖、迁移、侵袭,促进LSCC凋亡,增加LSCC细胞放疗敏感性,其功能极有可能是通过靶向作用于XIAP实现的。miR-24有成为LSCC诊断和预后有效标记物的潜力,开发针对miR-24的药物并与放疗联合使用可有望成为提高LSCC患者疗效的有效方法。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.65

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