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《第四军医大学》 2017年
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NLRP3在铅暴露诱导神经炎症反应中的作用及机制

苏鹏  
【摘要】:【背景】随着现代文明的不断发展,重金属铅的环境污染问题逐渐被人们重视,并且成为世界范围的公共安全问题。铅中毒能够引起人体多个器官和系统的功能紊乱和缺失,而目前研究最为关注的是铅的神经毒性,特别是铅对发育期的神经毒性。我们之前的研究显示,早期铅暴露能诱导铅神经毒性的发生,并且铅神经毒性的作用机制有多个方面,其中铅暴露诱导小胶质细胞活化进而引起神经炎症反应是其发挥神经毒性的重要机制之一。炎症体这一概念自2002年提出后,便引起的广泛的重视,炎症体介导的神经炎症反应在多种神经疾病的病程和预后中发挥了极为关键的作用。其中研究最多的,发挥功能最明显的是NLRP3炎症体。在中枢神经系统中,NLRP3炎症体主要表达在小胶质细胞中,受到外界刺激后,NLRP3炎症体的激活会导致下游Caspase-1的剪切,进而促进IL-1β的成熟和释放。目前,NLRP3炎症体的激活在多种神经系统疾病中得到证实,但是NLRP3在铅诱导的神经炎症反应中是否发挥作用,尚未见报道。NLRP3的调控机制复杂,目前研究热点主要集中在内环境调控、转录水平调控和信号转导。自噬是维持细胞正常生理功能的重要机制之一,近期研究显示小胶质细胞自噬对NLRP3炎症体也有调节作用;铅暴露是否影响小胶质细胞中的自噬功能目前尚未报道,并且自噬是否参与铅诱导的神经炎症反应以及NLRP3炎症体的激活过程也尚不清楚;NF-κB信号转导通路在调控NLRP3的活性中发挥了不可替代的作用,其是否参与铅对NLRP3的激活也尚无定论。【目的】通过建立体内、体外铅暴露模型,验证铅暴露诱导小胶质细胞活化进而引起神经炎症反应的现象;通过检测体内体外NLRP3的表达情况,确定铅暴露对NLRP3炎症体表达的影响,并通过抑制NLRP3的表达,证实NLRP3在铅神经毒性中的作用;从内环境调控和信号转导的角度探究铅暴露诱导NLRP3炎症体表达改变的作用机制,为了进一步阐明铅神经毒性的作用机制提供新的思路和方向。【方法】1.通过建立体内、体外铅暴露模型,采用免疫荧光染色,分子生物学实验等实验技术,检测铅暴露对小胶质细胞的形态影响和炎性因子的释放情况,以及对神经元的损伤情况;2.利用上述铅暴露模型,检测体内外NLRP3炎症体的表达情况,并且通过构建转基因小鼠和siRNA干扰技术,利用多种实验手段,观察抑制NLRP3炎症体的激活对铅诱导的神经炎症反应的影响;3.利用活细胞观察,免疫细胞荧光以及分子生物学实验方法观察小胶质细胞自噬在铅处理后的表达情况,利用抑制剂和干扰RNA技术,检测抑制自噬后对小胶质细胞释放炎性因子的影响,并进一步检测抑制自噬后对NLRP3炎症体的影响及机制;4.利用分子生物学技术,检测铅暴露对NF-κB信号通路的作用,通过加入抑制剂的方式检测NF-κB信号通路在调控铅诱导NLRP3激活中发挥的作用,并进一步确定NLRP3与自噬的相互关系。【结果】1.体内、体外铅暴露模型结果显示铅暴露能诱导海马区小胶质细胞的活化,从而引起神经炎症反应。孕期铅暴露动物模型结果显示,对照组相比,染铅组仔鼠的血铅值显著高于对照组,差异上有统计学意义(P0.05),水迷宫结果显示染铅组小鼠的平台区潜伏期时间显著高于对照组小鼠(P0.05);染铅组中TUNEL阳性的细胞比例显著升高(P0.05),并且染铅组的小胶质细胞活化比例明显增加(P0.05);原代小胶质细胞和BV2细胞结果显示,铅暴露后CD68阳性的细胞比例明显增加,胞体明显增大,并且炎性因子的mRNA表达和释放量都明显增加(P0.05)。2.NLRP3参与铅暴露诱导的神经炎症反应。体内结果显示铅暴露能显著增加海马区小胶质细胞中NLRP3的表达量,并增加Caspase-1的剪切和IL-1β的蛋白表达(P0.05);铅、LPS刺激均能显著增加BV2细胞中NLRP3及相关蛋白的表达;加入NLRP3-siRNA能抑制BV2细胞中NLRP3及下游分子的表达,并且能降低IL-1β的mRNA水平和释放量(P0.05);通过NLRP3基因敲除小鼠构建铅暴露模型,结果显示野生型和NLRP3敲除鼠的血铅值没有明显差异(P0.05);NLRP3敲除鼠的运动能力有所改变,并且敲除NLRP3不会增加小鼠海马区的凋亡,但能够抑制铅诱导的细胞凋亡;敲除NLRP3不影响小胶质细胞的数量,但影响铅暴露后小胶质细胞的形态;敲除NLRP3能减少体内NLRP3的激活,并降低部分炎性因子的表达。3.自噬参与调节铅暴露诱导的神经炎症反应及NLRP3的活化。铅暴露后能显著增加小胶质细胞中LC3阳性泡的聚集,并增加多种自噬相关蛋白的表达(P0.05);3-MA或者Atg5-siRNA能显著抑制自噬的表达,并且抑制BV2细胞中的炎性因子的mRNA表达(P0.05),降低NLRP3及下游相关蛋白的蛋白表达(P0.05)。4.NF-κB信号通路参与铅对NLRP3炎症体的调控。铅暴露后能显著增加小鼠海马区NF-κB的磷酸化水平(P0.05);在BV2细胞中利用PDTC抑制NF-κB的磷酸化后能显著降低铅刺激诱导的NF-κB和NLRP3及下游分子的蛋白表达(P0.05);通过加入3-MA能部分抑制NF-κB的磷酸化并能显著降低NLRP3的激活程度。【结论】1.孕期铅暴露模型结果提示铅暴露主要导致小鼠空间学习记忆能力下降;体内和体外实验均证实,铅暴露后小胶质细胞形态改变并且释放多种炎性因子,提示铅暴露诱导神经炎症反应可能是导致铅神经毒性的重要原因。2.铅暴露能增加体内、体外NLRP3炎症体的表达,并且促进Caspase-1的剪切和IL-1β的表达,而通过siRNA干扰技术和基因敲除动物实验抑制NLRP3能显著降低铅诱导的神经炎症反应,提示NLRP3在铅诱导的神经炎症反应中发挥重要作用。3.铅暴露能导致小胶质中自噬相关蛋白的升高,通过抑制自噬紊乱能显著降低铅暴露对小胶质细胞的活化作用,提示小胶质细胞自噬在调节铅暴露诱导神经炎症反应中可能发挥重要作用。4.抑制自噬水平降低NF-κB的活化提示自噬对炎症反应的调控可能不仅仅通过对NLRP3的调控;抑制NF-κB信号通路能显著降低铅诱导的NLRP3的激活,提示铅对NLRP3的调控可能通过介导NF-κB信号通路。综上所述,上述研究证明了铅暴露诱导神经炎症反应中的相关机制,率先发现NLRP3炎症体在铅神经炎症反应中的重要作用,揭示了自噬和NF-κB信号通路在调控铅诱导的NLRP3炎症体激活中的作用。研究结果为进一步研究铅神经毒性提供了新的理论依据,并且为铅毒性防护提供了思路和方向。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R114

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