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《第四军医大学》 2017年
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RNA结合蛋白QKI缺失对致耐受树突状细胞的功能促进及机制研究

姜英浩  
【摘要】:免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,是防卫病原体入侵最有效的武器。在免疫系统中,树突状细胞(DC)是最重要的抗原提呈细胞,它的特征是能通过高效地摄取、加工处理和递呈抗原,实现免疫监视和免疫调控功能。DC未成熟时摄取抗原和迁移能力较强,但对T细胞的激活能力较弱;成熟后的DC能有效递呈特异性抗原,分泌相关细胞因子,激活初始型T细胞,启动、调控、并维持免疫应答。DC既能启动初始免疫应答,也能负向调控抑制免疫效应,这种双向的免疫调节作用与DC自身命运决定以及参与功能调控的诸多分子有关[1,2]。致耐受DC(Tolerogenic DC)是DC的一个分类,以抑制免疫活化、维持免疫耐受状态为主要功能,致耐受DC的主要特征是低抗原提呈分子表达、低迁移能力、高免疫调节因子(TGF-β)等,近年来因其在自免性疾病、器官移植等领域的应用潜力,逐渐得到学界的认识和重视。细胞在不同的环境下代谢水平发生改变。当细胞状态或代谢水平受到剧烈影响时,细胞产生整合应激反应(Integrated Stress Response,ISR),激活相关信号,抑制蛋白继续合成[3]。多种信号分子在表观遗传、转录、转录后、翻译、翻译后等水平的调节下发生自身表达、活性的改变。其中转录后调控是最重要的调控方式之一。信号分子通过转录后调控,可以抑制特定蛋白质合成,促进蛋白质降解,实现对细胞代谢水平进行调节,以适应环境的变化[4]。针对DC的代谢调控可能是使其免疫调节方向改变的原因[5]。氨基酸代谢是细胞代谢中的重要组成部分。IDO1是催化色氨酸分子中吡咯环氧化裂解、沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶。文献报道IDO1的高表达可以通过多种途径产生抑制免疫的效应,与机体免疫系统抑制和免疫耐受密切相关[6-12]。RNA结合蛋白QKI是重要的转录后调控因子之一,参与多种器官和系统的调控。以往的研究表明QKI参与了血管和神经的分化和发育。我们前期研究也表明,QKI参与了结肠上皮的分化过程以及巨噬细胞的分化过程。但QKI在DC中的功能尚未见报道。本研究中我们对QKI在DC细胞中发挥的功能和调控的机制进行初步探讨。目的:1)探讨QKI在DC细胞分化和成熟过程中的表达变化;2)建立QKI敲除后DC细胞诱导培养模型,探讨QKI缺失对DC细胞自身增殖和分化水平的影响;3)探讨QKI缺失对DC细胞成熟、活化、分泌能力的影响;4)探讨QKI缺失对DC细胞激活T细胞,调控T细胞分化方向的影响;5)探讨IDO1代谢通路活化在QKI缺失的DC细胞中发挥的作用和机制。方法和结果:1)首先我们构建了小鼠骨髓来源单核细胞诱导的树突状细胞(BMDC)模型,经RT-PCR、Western、流式细胞术、ELISA验证DC细胞分化、成熟、活化指标证明我们的模型构建成功。RT-PCR和Western结果显示QKI在BMDCs成熟的过程中表达水平逐渐增高。提示QKI可能直接参与DC细胞的成熟和功能调控。2)我们通过Cre-ERTM-QKI-Loxp诱导敲除小鼠模型建立了QKI特异性敲除的BMDCs。流式细胞术验证了QKI敲除后,单核细胞向DC的分化比例增加,同时DCs的增殖水平上升。但流式细胞术结果显示该群DC细胞的共刺激分子表达水平降低。利用慢病毒载体感染DC细胞,结果显示在敲除QKI的DC中使QKI表达恢复后,细胞表面共刺激分子表达水平得到一定回升。由此提示QKI敲除会抑制DC细胞的免疫激活功能。3)利用以上QKI敲除的BMDCs模型对DC相关细胞因子的分泌进行检测,ELISA结果显示QKI敲除后的BMDCs免疫抑制性细胞因子TGF-β分泌显著增加;同时RT-PCR检测发现QKI敲除抑制了BMDCs的趋化因子表达,抑制了DC细胞的迁移能力。4)我们随后对特异性敲除QKI的BMDCs细胞与小鼠脾脏分离的T细胞共培养,观察该群DC细胞对T细胞活化和分化的调控。流式细胞术结果显示QKI敲除抑制了BMDCs表达特异MHC I分子的能力,同时上调了免疫抑制性配体PD-L1与PD-L2的表达。将敲除QKI的BMDCs与T细胞共培养,T细胞向Th1分化能力明显减弱,同时向Treg分化比例显著增高。ELISA结果显示缺失QKI的BMDCs与T细胞共培养上清中免疫激活型细胞因子IL-2与IFN-γ分泌显著降低,免疫抑制性细胞因子TGF-β分泌显著上调。证明敲除QKI的DC细胞能够通过直接接触与旁分泌的形式发挥对T细胞命运分化的影响,即抑制T细胞向效应T细胞分化,同时促进其向Treg分化,产生免疫抑制和免疫耐受的功能。5)对QKI调控DC细胞功能的机制进行初步探讨。利用DCFH-DA荧光探针检测我们发现敲除QKI的BMDCs内整体ROS水平降低,通过RT-PCR和Western检测到免疫抑制性相关代谢分子IDO1在缺失QKI的BMDCs中表达上调。IDO1-GCN2-e IF-2α通路的激活增强了DC细胞内的ISR反应,造成细胞内自噬水平增加,蛋白合成能力降低。给予细胞IDO1抑制剂1-MT处理可以抑制上述通路的活化,部分恢复细胞的免疫激活表型。结论:本课题中我们首次发现了特异性敲除QKI可以促进DC细胞的增殖和分化;但同时,敲除QKI会抑制DC活化性信号的激活,并促进抑制性分子的表达。QKI缺失的DC细胞通过表面抑制性配体直接接触以及旁分泌细胞因子的形式诱导CD4+T细胞向Treg分化,产生致免疫耐受(Tolerogenic)的表型。同时我们发现QKI可能参与IDO1-GCN2代谢调控通路。这为对致耐受性DC(Tolerogenic DC)的研究,以及对QKI分子的功能研究提供了新的思路和方向。此外,这种致耐受性的DC有潜力应用于临床上自免性疾病以及器官移植后的防治免疫排斥等。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R392

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