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《第四军医大学》 2017年
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SIRT6在黑素瘤中的表达及调控黑素瘤细胞生长的机制研究

王李雯  
【摘要】:背景:黑素瘤是起源于皮肤黑素细胞的恶性肿瘤,其发展迅速,不易治疗。虽然针对基因突变或肿瘤免疫的分子靶向治疗为黑素瘤患者提供了新的治疗手段,但随之而来的副作用及耐药现象严重降低了其治疗效率及临床应用。这一结果提示:黑素瘤发生发展过程中存在其他调控机制,针对未知机制的探讨将有助于从根本上提升黑素瘤的诊疗水平。自噬是细胞内重要的生理过程,通过降解变性、受损以及失去功能的细胞器及蛋白等成分维持细胞内环境稳态并在应激条件下为细胞提供必要的能量供给。近年来大量研究表明,自噬是维持肿瘤生长的重要供能方式,在黑素瘤中具有早期抑制肿瘤发生而晚期促进肿瘤进展的双重作用,然而介导这一双重作用的上游调控机制尚未完全阐明。SIRT6作为Sirtuins家族成员,在DNA修复、基因表达调控、衰老及抑制炎症等过程中发挥重要作用。目前被认为是细胞内葡萄糖稳态的主要调控者,可通过生长因子介导的多个网络调控机制影响代谢,是肿瘤能量代谢的关键调控分子。研究表明,SIRT6介导的自噬水平变化在氧化应激诱导的神经细胞凋亡损伤及吸烟引起的支气管上皮细胞衰老中,发挥促进损伤和抑制衰老的双向作用。这一现象提示:SIRT6可能是黑素瘤中导致自噬差异表达的原因之一。然而,上述研究均集中于衰老、炎症等非肿瘤疾病中,肿瘤中尤其黑素瘤中SIRT6对自噬的调控及其作用机制尚不明确。针对这一问题的深入研究有助于深化SIRT6对自噬调控的认识,拓展二者参与调控的疾病谱。并为黑素瘤的临床诊疗提供新的思路及治疗靶点,对黑素瘤临床选择用药具有重要意义。基于以上研究发现,我们提出以下科学假说:在不同分期黑素瘤中,SIRT6可通过调控细胞内自噬水平发挥抑制早期黑素瘤生长而促进晚期黑素瘤生长的双重作用。目的:1.检测并验证黑素瘤中SIRT6与细胞自噬水平的表达及其相关性分析;2.明确黑素瘤中SIRT6对细胞自噬的调控作用及其功能;3.阐明SIRT6调控细胞自噬参与黑素瘤细胞生长的分子机制。方法:1.利用qRT-PCR、Western blot及免疫荧光技术从组织、细胞系水平对SIRT6mRNA、蛋白水平及定位进行检测;同时,利用Western blot、免疫荧光技术对自噬相关分子LC3、SQSTM1/p62蛋白表达进行检测;利用相关性分析对SIRT6及自噬相关分子的蛋白表达灰度值进行统计分析;明确二者的相关性;2.利用基因干扰技术,过表达/干涉SIRT6,应用CCK8检测SIRT6对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术检测其对细胞生长周期的影响;利用western blot、流式技术检测SIRT6对黑素瘤细胞凋亡的影响;3.分别利用基因干扰技术过表达/干涉自噬相关基因ATG5或自噬调节剂刺激细胞,应用CCK8检测自噬对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术检测其对细胞生长周期的影响;利用western blot、流式技术检测对黑素瘤细胞凋亡的影响;4.过表达/干涉SIRT6,联合应用自噬激动剂雷帕霉素或抑制剂氯喹,利用western blot、电镜、免疫荧光技术检测干预SIRT6对黑素瘤细胞自噬水平的影响;5.过表达/干涉SIRT6,联合应用自噬激动剂雷帕霉素或抑制剂氯喹,应用CCK8检测SIRT6调控细胞自噬对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术检测其对细胞生长周期的影响;利用western blot、流式技术检测SIRT6调控细胞自噬对黑素瘤细胞凋亡的影响;6.利用qRT-PCR、Western blot技术从组织、细胞系水平对IGF1R mRNA、蛋白水平进行检测;同时,利用Western blot技术对IGF-Akt信号通路相关分子蛋白水平进行检测;利用相关性分析对SIRT6及通路关键分子p-IGF1R、p-Akt473的蛋白表达灰度值进行统计分析;明确二者的相关性;7.过表达/干涉SIRT6,联合过表达Akt或应用Akt1/2激酶抑制剂,利用western blot技术检测干预SIRT6对IGF-Akt信号通路相关分子活化的影响;8.过表达Akt或应用Akt1/2激酶抑制剂,联合过表达/干涉SIRT6,利用western blot技术检测干预IGF-Akt信号通路对SIRT6调控自噬的影响;9.过表达Akt或应用Akt1/2激酶抑制剂,联合过表达/干涉SIRT6,利用CCK8检测IGF-Akt信号通路对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术检测其对细胞生长周期的影响;利用流式技术检测IGF-Akt信号通路对黑素瘤细胞凋亡的影响;10.过表达/干涉SIRT6,利用裸鼠荷瘤模型检测SIRT6对黑素瘤细胞生长的影响;利用Western blot技术检测成瘤体内SIRT6对IGF-Akt信号通路及自噬的影响;利用统计分析及组织病理学技术检测裸鼠荷瘤模型脏器转移能力。结果:1.与色素痣及原代黑素细胞相比,原发黑素瘤组织及细胞系中SIRT6及自噬表达水平均降低,而转移黑素瘤组织及细胞系中SIRT6及自噬表达水平均升高,且二者呈线性正相关;选取SIRT6低表达及高表达的WM35、WM793B、A2058、A375四株细胞系为研究对象进行后续实验;2.CCK8结果显示:干预SIRT6表达可抑制不同分期黑素瘤细胞生长活性;细胞周期结果显示:干预SIRT6表达可使不同分期黑素瘤细胞发生G1期阻滞;Western blot及流式结果显示:干预SIRT6表达可促进不同分期黑素瘤细胞促凋亡蛋白的表达及细胞凋亡的发生;3.CCK8结果显示:干预ATG5表达或应用自噬调节剂可抑制不同分期黑素瘤细胞生长活性;细胞周期结果显示:干预ATG5表达或应用自噬调节剂可使不同分期黑素瘤细胞发生G1期阻滞;Western blot及流式结果显示:干预ATG5表达或应用自噬调节剂可促进不同分期黑素瘤细胞促凋亡蛋白的表达及细胞凋亡的发生;4.Western blot、电镜、免疫荧光结果显示:SIRT6可正向调控黑素瘤细胞内自噬水平;5.CCK8结果显示:干预SIRT6表达联合应用自噬调节剂后,可部分回复SIRT6对于不同分期黑素瘤细胞生长活性的抑制;细胞周期结果显示:干预SIRT6表达联合应用自噬调节剂后,可部分回复SIRT6对于不同分期黑素瘤细胞G1期阻滞的影响;流式结果显示:干预SIRT6表达联合应用自噬调节剂后,可部分回复SIRT6对不同分期黑素瘤细胞凋亡的促进作用;6.与色素痣及原代黑素细胞相比,原发黑素瘤组织及细胞系中IGF-Akt信号通路活化水平均升高,而转移黑素瘤组织及细胞系中表达水平均降低,SIRT6与IGF-Akt信号通路二者之间呈线性负相关;7.Western blot结果显示:干预SIRT6表达可负向调控IGF-Akt信号通路的活化;8.Western blot结果显示:干预SIRT6表达联合过表达Akt或抑制Akt活性后,SIRT6可通过负向调控IGF-Akt信号通路上调黑素瘤细胞内的自噬水平;9.CCK8结果显示:干预SIRT6表达联合过表达Akt或抑制Akt活性后,可部分回复SIRT6对于不同分期黑素瘤细胞生长活性的抑制;细胞周期结果显示:干预SIRT6表达联合过表达Akt或抑制Akt活性后,可部分回复SIRT6对于不同分期黑素瘤细胞G1期阻滞的影响;流式结果显示:干预SIRT6表达联合过表达Akt或抑制Akt活性后,可部分回复SIRT6对不同分期黑素瘤细胞凋亡的促进作用;10.裸鼠荷瘤实验显示:SIRT6可减少原发黑素瘤瘤体的体积及重量,增加转移黑素瘤瘤体的体积及重量;Western blot结果显示:过表达SIRT6可抑制IGF-Akt信号通路,上调细胞自噬水平;干涉SIRT6可进一步活化IGF-Akt信号通路,抑制自噬水平。脏器转移统计结果显示:在SIRT6本底水平高表达的转移黑素瘤细胞系中,较干涉SIRT6组,其肝脏转移灶数目显著增加;组织病理学检查结果显示:SIRT6本底水平高表达的转移黑素瘤细胞系的裸鼠肝脏内可见较多的异型细胞。结论:通过本课题的研究,我们首次发现黑素瘤中SIRT6在早期低表达而晚期高表达的双向表达模式,并且其通过负向调控IGF-Akt信号通路介导黑素瘤细胞自噬水平的双向表达,SIRT6可促进黑素瘤细胞自噬水平的升高。这一机制参与SIRT6调控黑素瘤细胞生长的过程。我们的发现加深了SIRT6对自噬调控的认识,拓展了二者参与调控的疾病谱。并为黑素瘤的临床诊疗提供新的思路及治疗靶点,对黑素瘤临床选择用药具有重要意义。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.5

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