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《第四军医大学》 2017年
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Src磷酸化参与低剂量铅暴露致大脑屏障损伤及其转运的机制研究

宋晗  
【摘要】:背景铅是一种广泛分布的环境污染物。铅暴露可诱导产生一系列中枢神经毒性效应,包括智商的降低、认知缺陷、注意力涣散以及攻击行为的增加等。发育期的大脑屏障是铅神经毒性的重要靶点之一,主要包括血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)和血脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)。脑微血管内皮细胞及细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)、星形胶质细胞的终足、基膜和周细胞是BBB的结构基础,而脉络丛上皮细胞及细胞间的TJ构成了BCB。以往研究发现铅暴露可以引起BBB和BCB紧密连接蛋白(tight junction proteins,TJPs)表达水平下降,导致TJ结构的破坏和屏障通透性的增高。然而,铅暴露导致TJPs水平降低的机制目前尚不清楚。铅进入脑实质或者脑脊液的途径尚未完全揭示,已知铅入脑的主要途径有两种:一是破坏TJ后从细胞间的区域穿过,二是通过大脑屏障细胞上的铅转运体蛋白或转运通道摄入。Connexin 43(Cx43)是BBB和BCB中表达最为广泛的缝隙连接(gap junction,GJ)分子,Cx43半孔道近来被发现是多种物质的转运孔道。既往文献显示,铅暴露可引起海马脑区Cx43的表达增高,而海马是脑内铅蓄积的重要部位,提示Cx43半孔道可能具有转运铅的功能。Src是非受体型蛋白酪氨酸激酶,可在细胞与细胞外基质界面的粘着复合体上介导整合素的信号。Src激酶的活性对于上皮细胞TJPs的组装和降解都至关重要。而且,Src还可直接与Cx43相互作用,并通过磷酸化Cx43来降低GJ介导的细胞间通讯(GJ-mediated intercellular communication,GJIC)、引起GJ的降解和孔道的关闭。本实验室前期研究发现:铅暴露大鼠大脑微血管组织中Src磷酸化显著上调,且增高幅度高于其他蛋白激酶。目的本课题的研究目的在于明确:(1)铅暴露是否通过Src激酶途径改变BBB与BCB的TJ蛋白的表达;(2)Cx43在脑微血管内皮细胞和脉络丛上皮细胞中摄取铅的作用;(3)Src磷酸化是否参与调控Cx43的表达及细胞的铅蓄积。方法1.以大鼠大脑微血管内皮细胞系(RBE4)和脉络丛上皮细胞系(Z310)作为研究对象,分别建立BBB和BCB的体外模型。采用原子吸收分光光度法检测细胞铅吸收量。2.Western blot法检测细胞P-Src、C-Src、GRP78、Cx43等蛋白表达水平的变化。q RT-PCR技术检测GRP78、Cx43等分子的m RNA水平。3.免疫细胞化学法检测GRP78、Cx43在细胞中的分布,免疫电镜、生物素标记活细胞膜蛋白等技术检测RBE4细胞中GRP78定位和分布的变化。4.采用溴化乙锭(Eth Br)摄取实验检测细胞Cx43半孔道的吸收功能。5.采用si RNA干涉技术抑制GRP78的表达水平,观察其对Src、occludin和ZO-1等蛋白表达的影响。使用Src信号通路阻断剂,检测抑制Src磷酸化对GRP78、Cx43、occludin和ZO-1等蛋白表达的影响。6.基于Z310细胞构建可诱导表达细胞系i ZCx43,实现可控的四环素诱导Cx43高表达,原子吸收分光光度法检测Cx43表达变化对细胞铅吸收的影响。结果1.铅处理RBE4和Z310细胞24 h后,Src的磷酸化均显著增加,但是其上游分子GRP78仅在RBE4细胞中出现上调。阻断Src的磷酸化可逆转铅暴露所引起occludin水平的降低,但对ZO-1则无此作用。2.在RBE4细胞中,GRP78 si RNA干涉可减弱铅所诱导的Src磷酸化和occludin水平的降低。免疫细胞化学发现铅暴露能够引起GRP78蛋白的分布范围从内质网向细胞质和细胞膜扩散。中和抗体封闭膜表面GRP78未能引起Src磷酸化的逆转,提示细胞质GRP78,而非膜表面GRP78,参与铅激活Src磷酸化及随后occludin水平的降低。3.铅暴露可上调RBE4细胞Cx43的蛋白水平,下调Z310细胞Cx43的蛋白水平,而RBE4细胞蓄积铅的能力高于Z310细胞,说明Cx43的上调能增加RBE4细胞的铅吸收量,而它的下调则限制Z310细胞的铅吸收。降低培养基中的血清浓度可诱导Cx43半孔道开放,同时细胞的铅吸收也显著增加。Cx43介导的铅吸收可被Cx43的半孔道抑制剂显著阻断。瞬时过表达Cx43可引起细胞铅吸收量的增加。以四环素诱导i ZCx43细胞Cx43表达增高后,细胞的铅吸收量也显著增加。4.在RBE4细胞中,Src通路的激活参与铅暴露致Cx43的上调,提示铅暴露可能通过促进Src磷酸化而增加细胞的铅吸收;而在Z310细胞中,铅暴露可诱导Src通路激活,但同时Cx43蛋白水平和细胞铅吸收量下降,提示在Z310细胞中除Cx43外,还可能存在其他受Src调控的铅转运相关分子。结论在大脑屏障细胞中,铅暴露可通过促进Src激酶的磷酸化,从而引起occludin蛋白水平的降低和屏障通透性的破坏;同时,Src激酶的磷酸化还能够调节大脑屏障细胞Cx43蛋白的表达,从而影响细胞膜表面Cx43半孔道对铅的吸收。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R114

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