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《第四军医大学》 2017年
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先天性巨结肠疾病相关基因PTPRR维持肠神经前体细胞多能性的作用及机制

田姣  
【摘要】:【研究目的】先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease,HSCR)是最常见的肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)发育障碍性疾病。大多数观点认为,肠神经前体细胞ENCCs介导的ENS发育障碍是疾病发生的内在原因。而受众多转录因子与生长因子调控其生物学行为的ENCCs,其发育的复杂性决定了HSCR病因学的复杂性及多因素性。导致疾病类型及严重程度的差异由多种遗传因素及环境因子共同引起。为了更好地理解该疾病,有必要从多角度多层次全面解析ENS形成过程中ENCCs的生物学行为影响机制,从而为HSCR病因及病机研究作进一步探索。【研究方法】本课题拟以HSCR为研究对象,采用基因芯片技术对临床标本的差异表达基因进行筛选,经过扩大样本人群验证目的基因差异表达后从临床标本检测、肠神经嵴干细胞实验、RNA干扰实验等多层次研究手段,通过分析人体肠道组织PTPRR的表达模式及分布特点,以及干预PTPRR基因表达对神经嵴干细胞生物学行为的影响,从分子水平、细胞水平观察PTPRR基因在ENS发生中发挥的重要作用。【研究结果】1.通过基因芯片技术筛选获得HSCR相关的lnc RNA与m RNA表达谱。总共获得2个lnc RNA和3个m RNA,其表达量的差异经扩大样本验证后在病变组织与对照组织中有统计学意义。生物信息学分析提示目的基因PTPRR主要参与ERK信号通路可逆的蛋白磷酸化调节,与神经元的增殖分化密切相关。2.PTPRR m RNA及蛋白表达水平在HSCR痉挛段显著降低,免疫荧光染色发现PTPRR主要表达于肌间神经丛内的神经节细胞与Sox10阳性的神经前体细胞存在共表达3.在原代培养的神经前体细胞中,PTPRR主要表达于神经前体细胞胞质部位,与Sox10呈共表达,诱导分化后PTPRR蛋白及m RNA表达水平较未分化的神经细胞显著降低。4.具有诱导外周神经嵴细胞向神经元细胞分化的BMP2及GDNF干预ENCCs后,球体中TUJ1阳性表达明显增多,同时出现明显的分化形态;而球体中GFAP的阳性表达明显减少甚至缺失。具有诱导外周神经嵴细胞向胶质细胞分化的NRG1干预ENCCs,荧光染色见球体中TUJ1阳性表达显著减少;而球体中GFAP的阳性表达明显增加,同时出现明显的分化形态。5.PTPRR在三种细胞因子干预后ENCCs中阳性表达均明显减少,同时Sox10的阳性表达率也出现相应减少。免疫印迹及RT-q PCR结果同免疫荧光染色,并且在这三种细胞因子中以GDNF的干预作用最显著。6.将过表达或下调PTPRR表达腺病毒转染ENCCs后,下调组PTPRR m RNA及蛋白表达量均显著下降;而过表达组PTPRR m RNA及蛋白表达量的均显著上调,表明成功实施基因干预技术。7.Ed U染色及免疫荧光法检测基因干预后ENCCs的增殖及分化情况,过表达组ENCCs中无明显分化细胞形态,同时Sox10阳性标记细胞数量显著增加,细胞增殖能力增加;而下调组ENCCs出现大量分化细胞,其中以TUJ1阳性表达的增加更显著,同时伴随Sox10阳性标记细胞数量显著减少以及细胞增殖能力的下降。8.在PTPRR基因干预前提下,通过免疫荧光染色及免疫印迹检测GDNF诱导磷酸化ERK1/2的激活发现,在PTPRR基因过表达组,p ERK1/2在细胞中的阳性荧光染色及蛋白水平均显著减少,与PTPRR基因下调组中p ERK1/2的阳性荧光染色及蛋白水平均显著增加结果相反,两组差异均具有统计学意义。【结论】PTPRR表达水平的下降与HSCR疾病的发病状态显著相关,并且表达于ENCCs的PTPRR通过负性调控ERK1/2的磷酸化,抑制神经前体细胞分化,发挥维持肠神经前体细胞多能性的功能。本研究为HSCR发病机制的研究提供新的思路和潜在治疗靶点。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R725.7

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