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《第四军医大学》 2017年
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基于iPS细胞和纳米纤维支架的组织工程心肌构建研究

陈焱  
【摘要】:【研究背景】心血管疾病是全球范围导致人类死亡的首要病因,近些年来每年全球范围内因心血管疾病死亡的人数占总死亡人数的比例均超过30%,已经造成了沉重的社会经济负担。心肌梗死是最常见的心血管疾病类型,在人群中具有很高的发病率和死亡率。心肌梗死导致心脏永久性损失数以亿计的功能心肌细胞,这些坏死损失的心肌细胞逐渐被成纤维细胞所形成的瘢痕组织替代,心脏随之发生重构,存活的患者最终将发展为心力衰竭直至死亡。人类心脏再生能力极为有限,一旦发生心肌梗死,功能心肌细胞的损失将无法得到弥补。当前所有的治疗方法和策略均只为补救性措施,比如药物治疗、冠脉介入手术治疗、以及外科搭桥手术治疗,虽然可以有效延缓疾病的发展,但它们均无法完全恢复心脏的功能或是逆转心脏重构。全心移植是重症心肌梗死患者目前唯一最有效的根治性治疗选择。在过去的十多年中,干细胞生物学方面的重大突破使得我们已经能够实现心肌细胞的再生,使得为这类疾病患者提供再生心脏的美好愿望成为可能。然而,当前基于干细胞的移植再生疗法仍然存在诸如细胞存活差、细胞滞留低、无法形成功能性心肌组织等难题,尚难以取得满意疗效。因此体外构建出可供移植的组织工程心肌移植体就成为了当前新的选择。【目的】利用诱导多能干细胞与纳米纤维支架构建较为成熟、具有机械/电偶联的一体化组织工程心肌移植物。【方法】1)分别采用拟胚体法和单层贴壁培养法进行鼠源Oct4-GFP+i PSC(induced pluripotent stem cell)培养分化,并进行心肌细胞标志物免疫染色,明确该i PSC细胞系向心肌细胞分化的可行性。2)添加抗坏血酸素(Ascorbic acid,AA)作为心肌分化诱导剂,观察、计数跳动EB的数量,借以评估抗坏血酸素的心肌分化诱导作用。3)采用静电纺丝技术生产聚己内酯(Poly-(ε-caprolactone),PCL)和聚己内酯/明胶(PCL/Gelatin)复合纳米纤维支架,用于i PSC的心肌分化诱导培养,明确支架平台可否适用于组织工程心肌构建。4)观察支架对i PSC心肌方向分化的作用,并探讨支架微观形貌对于心肌分化的影响及可能的信号机制。5)采用单层法联合多种分化诱导剂进一步提高心肌分化效率,获取大批量高纯度心肌细胞。6)利用纳米纤维支架进行i PSC源心肌细胞的成熟化培养,并进行成熟化指标评价。7)采用单层法联合多种分化诱导剂在纳米纤维支架上培养构建具有自主节律、能够同步收缩/舒张活动的组织工程心肌。【结果】1)采用悬滴法制得大小均一的拟胚体细胞团,能够自发分化出少量跳动的拟胚体;添加抗坏血酸素能够显著升高跳动拟胚体的比例,有效促进心肌分化;单层贴壁法同样也可以诱导我们的i PSC细胞系分化出心肌细胞,免疫染色结果证实c Tn I阳性细胞存在。证明该i PSC细胞具备心肌分化能力,可用于后续心肌组织构建。2)静电纺丝技术成功制得纤维直径为纳米级别的PCL和PCL/Gelatin复合支架,具备与细胞外基质类似的多孔隙三维立体结构;支架用于i PSC的培养分化能够获得c Tn T阳性、MLC2a阳性的心肌细胞,而且动态基因表达谱及心肌特异性蛋白质表达谱,均证实心肌细胞存在。证实这种纳米纤维支架平台适用于i PSC的心肌分化培养。3)同等分化条件下采用纳米纤维支架具有比培养皿更强的促i PSC心肌细胞分化作用,我们认为这一作用与纳米纤维支架的微观形貌有关。进一步调控经典Wnt信号通路,证实其参与了这一促分化作用。4)三维纳米纤维支架联合多种促心肌细胞分化因子,能够促进i PSC在支架上高效向心肌细胞分化。5)支架上分化获得的心肌细胞在肌节结构、心肌特异性蛋白MLC2v的表达方面显著强于培养皿对照,提示纳米纤维支架能够有效促进分化心肌细胞的成熟。6)通过综合运用分化诱导因子、纳米纤维支架和延长培养时间等措施,成功促使心肌细胞肌节发育更为完善、电镜下结构更为清晰、蛋白表达谱也更为成熟。7)利用支架作为培养载体,成功培养出具有自主节律、同步收缩/舒张的成熟心肌细胞合胞体,并证实这些心肌细胞之间存在大量缝隙连接结构,从而构成了它们机械/电耦联的基础。综上所述,静电纺丝生产的三维立体纳米纤维支架非常适合于用作i PSC心肌分化及心肌组织构建的平台;使用这种支架,在诱导因子辅助下能够培养出更为成熟的心肌细胞,并获得具有自主节律、同步化收缩/舒张功能的心肌组织合胞体。我们的研究为今后构建可用于移植的组织工程心肌提供了实践探索经验。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R54

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