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《第四军医大学》 2017年
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增厚结节型鲜红斑痣的超微结构、体细胞突变及分子机制研究

殷荣  
【摘要】:目的鲜红斑痣(Port wine stain,PWS)是一种发生在人皮肤真皮浅层先天性进行性发展的血管畸形,新生儿的发生率约为3-5‰,且85%的患者皮损发生于面部,常持续终生不退,给患者社会心理的成长带来极大的负面影响,是个急需解决的重要的临床问题。许多PWS患者在成年后皮损逐渐增厚并可能发展为增生结节型损害,成为临床治疗的难题,其发生发展的分子机理尚不清楚。本课题将从以下几个方面探索增厚结节型PWS的结构特点和形成机理:明确增厚结节型PWS不同细胞成分的超微结构病理特征;研究增厚结节型PWS中异常激活的相关激酶信号通路;筛查PWS结节型皮损中特异性的体细胞突变,为揭示其发生机制、探索更为有效的治疗方案提供理论依据。方法1、纳入16例PWS患者,收集其不同类型的皮损,6例患者取红斑型和结节型皮损各1份,5例患者仅取结节1份,5例患者仅取红斑组织1份,共收集结节红斑组织各11份;其中另收集7例面部正常皮肤为对照。将组织样本切割为0.5mm3的组织块,采用Karnovsky溶液(1%戊二醛和4%多聚甲醛溶于0.1M的磷酸盐缓冲液中)固定24小时,用1%四氧化锇后固定,所有样本逐级脱水、渗透、树脂包埋,用Leica Ultracut 7切片机制作厚度约为50 nm的超薄切片并染色,用透射电镜(Tecnai G2 Spirit,FEI,Hillsboro,Oregon)设置电压为80kV进行观察拍照。2、收集来自13例PWS病人的21份组织样本,包括8份增厚组织,8份结节组织以及PWS病人皮损周边正常组织5份(距离PWS皮损区约0.5-1 cm),另收集两例正常人皮肤组织作为对照。皮肤组织样本在福尔马林溶液中过夜固定,经过脱水清洗后嵌入石蜡中并做成5 mm厚石蜡包块,组织切片用HE染色,并且用光学显微镜采图。组织切片行免疫组化检测,冻存或新鲜组织提取蛋白行Western Blot检测,研究PKCα、PI3K、PDPK1、PLC-γ、PP2A、DAG等蛋白在PWS红斑及结节组织中的表达情况。3、收集4例PWS患者的皮肤组织样本,每例患者均分别获得红斑、结节及临近的正常皮肤组织。从新鲜及冻存组织中提取组织DNA,构建测序文库,经Agilent2100 bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)确定插入片段大小为100-250bp,使用Agilent SureSelect Human All Exon V5(50M)捕获平台进行外显子组捕获,洗脱富集的片段后进行PCR扩增,测序采用Hiseq 4000测序平台行全外显子测序。采用SAMtools(http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml)进行基因变异检测分析。结果1、PWS组织中存在代谢极度活跃的内皮细胞、周细胞、成纤维细胞,这些细胞胞质内都存在大量的粗面内质网、游离核糖体、高尔基复合体、增大的线粒体及大量囊泡。在真皮乳头和PWS血管周围可见过度增生肥大的胶原纤维束。在基底层的角质形成细胞中可以见到聚集的黑素小体及近核膜区粗大的张力纤维。基底膜带变薄、破坏、半桥粒减少,呈现退行性病变特征。2、在PWS组织中检测PKCα、PI3K、PDPK1、PLC-γ的磷酸化水平及PP2A和DAG的蛋白表达,发现在增厚的红斑组织较周边正常组织表达水平均有所增加;在结节组织中这些分子广泛表达于血管基质中;许多增生的细胞如成纤维细胞等,这些分子也表现出明显的活化及上调;Western Blot结果与免疫组化结果一致。上述结果表明,PKCα、PI3K、PDPK1和PLC-γ的异常激活及PP2A和DAG的上调不仅仅存在于增厚型PWS组织的内皮细胞中,也可见于结节型组织的血管及周围的成纤维细胞。3、外显子测序发现在PWS增厚和结节皮损中存在Trim69(c.825CT/p.T161M)、Muc6(p.Thr1807Ser/c.5420CG)、Muc3a(c.1951AT/p.Ser651Cys;c.1952GC/p.Ser651 Thr;c.1973 CT/p.Ser658 Leu;c.2014TC/p.Phe672Leu)等基因的错义突变。同时还发现仅出现在结节样本中的特异突变有Igfn1(c.5907AG/p.I2008M)错义突变,Mapk7(TC,Chr17:19285524)及Znf528(TC,Chr19:42729848)基因的同义突变。结论1、在PWS病理进行性发展中存在着代谢与增生活跃的内皮细胞、周细胞、成纤维细胞,直接导致血管及细胞外基质的增殖,从而导致软组织增生和结节形成。2、PI3K和PKCa信号通路的异常激活在鲜红斑痣皮损发展成为增厚及结节的过程中可能发挥重要作用。3、体细胞基因突变与PWS皮损的发生发展密切相关。Trim69(c.825CT/p.T161M)、Muc6(p.Thr1807Ser/c.5420CG)、Muc3a(c.1951AT/p.Ser651Cys;c.1952GC/p.Ser651 Thr;c.1973 CT/p.Ser658 Leu;c.2014TC/p.Phe672Leu)等基因突变参与PWS皮损增厚的病理进程,而Igfn1(c.5907AG/p.I2008M)等基因突变可能在PWS的结节形成中起到重要作用。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R758.51

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