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《第四军医大学》 2017年
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恶性脑胶质瘤TRAIL敏感性相关微小RNA的功能性筛选及靶向协同治疗策略的建立

张晓  
【摘要】:第一部分 恶性胶质瘤细胞TRAIL敏感性相关的microRNA的筛选、功能鉴定及机制研究【背景】恶性胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性的脑肿瘤之一,中位生存时间不超过16个月。尽管对于它的治疗已取得很大的进展,但它仍然是最具挑战性的疾病之一。TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)能够特异性地杀伤肿瘤而不影响正常细胞,因此是很有潜力的抗癌药物。但是已有研究表明,许多肿瘤对其耐受,且在临床试验中,TRAIL因其半衰期短以及体内的不稳定致使其实际应用受到了很大限制。然而,最近的研究表明,使用间充质干细胞(MSCs)表达TRAIL可将TRAIL特异性地运送到肿瘤局部,这可在一定程度上补偿这一缺点。MicroRNA,一类在进化上高度保守的非编码小RNA,可以通过与靶基因的3'非翻译区(UTRs)结合发挥转录后调控作用,进而抑制mRNA翻译或降解mRNA。越来越多的证据表明,miRNA在肿瘤细胞的恶性表型的调控中发挥着关键作用,而且已有研究证实,细胞可以外泌体的形式分泌miRNA,进而下调受体细胞中靶基因的表达。因此,这提示我们,联合使用MSCs、microRNA、TRAIL进行肿瘤靶向治疗的策略或许会有很好的治疗前景。【目的】找出可以增敏TRAIL的microRNA,并使用MSCs作为运载工具开展靶向治疗。【方法】为了找到在胶质瘤中可增敏TRAIL的关键microRNA,我们首先对对TRAIL表现不同敏感程度的胶质瘤细胞系进行mi RNA表达谱的分析,从中找到与TRAIL诱导的凋亡呈现显著相关性的miRNAs。之后在不同的细胞中过表达或干涉该microRNA,检测TRAIL诱导细胞凋亡的情况,进而确认增敏TRAIL的关键microRNA。然后通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR和蛋白印迹实验,找到该miRNA的下游靶基因。同时,通过功能缺失和恢复实验,进一步确定这样一条调控轴线。然后对MSCs进行改造,使其携带TRAIL和该microRNA,与胶质瘤细胞系U87进行体外共培养实验,验证基因修饰后的MSCs是否可以显著杀伤肿瘤细胞。同时,利用外泌体的抑制剂来进行分析,这种影响是否通过外泌体介导的分子传递来完成的。之后分别通过transwell实验和免疫组化实验在体外和体内实验中分析,携带TRAIL和microRNA的MSCs是否具有较好的肿瘤趋向性。最后建立裸鼠皮下荷瘤模型,使用TRAIL和microRNA联合过表达的MSCs进行尾静脉治疗实验,确认治疗效果。【结果】我们发现,miR-7在胶质瘤细胞系中的表达情况与TRAIL诱导的细胞凋亡存在显著的正相关关系。之后,功能缺失和恢复实验证实,miR-7确实是胶质瘤细胞系中增敏TRAIL关键分子。随后,在机制研究中,我们发现,XIAP是其介导该作用的关键的下游靶基因,进一步的研究发现,miR-7-XIAP这种调控关系存在于多种肿瘤中。而且,体内体外实验证实,携带TRAIL和microRNA-7的间充质干细胞具备很好的肿瘤趋向性。同时,通过外泌体抑制实验证实,MSCs可以以外泌体的形式分泌microRNA-7进而下调受体细胞中的XIAP,从而增强受体细胞的凋亡。最后,更重要的是,在裸鼠移植瘤的治疗模型中,TRAIL和microRNA-7联合过表达的间充质干细胞表现出很好的促凋亡作用,从而抑制肿瘤的生长,达到较好的治疗效果。【结论】在肿瘤细胞中,miR-7可以通过下调XIAP显著增强TRAIL诱导的细胞凋亡。携带TRAIL和miR-7的MSCs可以特异性地趋向于肿瘤局部,抑制肿瘤的生长。第二部分 microRNA-7在肝癌细胞中的抑癌新机制研究【背景】Micro RNA(miRNA)分子是一类在多细胞生物中广泛转录的、普遍存在的非编码小RNA分子。成熟的mi RNA分子可通过序列特异性的碱基互补配对结合到m RNA的3’非编码区,形成RNA沉默复合物,进而导致靶m RNA的翻译抑制或直接将其降解。更重要的是,一个mi RNA可以同时调节上百种m RNA,这也使得其能够参与错综复杂的分子调控网络,进而影响细胞的生命活动。越来越多的研究表明,mi RNA的正常表达是生命活动正常运转所必需的,而它的失调可能会导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生。近来研究发现,在肝癌的发生发展过程中伴随着一些抑癌mi RNA的下调,而在这些mi RNA中,mi R-7在肝癌组织中显著低表达,且mi R-7的过表达能够抑制肝癌的增殖和转移。也有研究证实,mi R-7可以通过靶向PI3K/AKT通路抑制肝癌的生长和转移。但是,这些都还不能充分揭示mi R-7在肝癌中发挥的关键抑癌作用。【目的】阐明microRNA-7在HCC细胞中的新的抑癌机制。【方法】首先,在肝癌细胞中瞬时转染miR-7,48小时后使用流式细胞术检测细胞周期。之后,通过生物信息学预测工具分析预测mi R-7的可能下游靶基因,随后通过双荧光素酶报告基因实验初步确认mi R-7的下游靶基因。然后通过实时定量PCR和Western blot检测mi R-7过表达后的靶基因的m RNA和蛋白表达水平的变化,同时通过功能缺失和恢复实验进一步确认靶基因与细胞周期的关系。最后在肿瘤临床样品和肿瘤细胞系中分析mi R-7与靶基因的RNA表达水平的相关性。【结果】首先,我们发现,在肝癌细胞中过表达miR-7可以显著导致细胞周期G1期阻滞。之后通过生物信息学预测、报告基因实验、实时定量PCR和蛋白印迹实验证实,细胞周期蛋白CCNE1是mi R-7发挥该抑制作用的关键下游靶基因。进一步的研究证实,干涉CCNE1与过表达mi R-7导致相似的细胞周期变化,同时CCNE1的恢复过表达可以消除mi R-7引起的细胞周期G1期阻滞。最后,临床组织样品和细胞系的结果显示,mi R-7与CCNE1的表达水平存在着显著的负相关关系。【结论】miR-7可以直接靶向下调细胞周期蛋白CCNE1的表达,进而导致细胞周期G1期阻滞,从而抑制肝癌细胞增殖。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.41

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