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《第四军医大学》 2017年
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氧化应激敏感的TRPM2活化NLRP3炎症小体参与白癜风异常免疫应答的机制研究

李舒丽  
【摘要】:背景:白癜风是一种常见的自身免疫性皮肤病,其黑素细胞破坏主要系CD8~+T细胞介导的免疫损伤所致。文献及我们以往的研究表明,氧化应激是导致白癜风发病的重要原因,并证实角质形成细胞在氧化应激下,对白癜风局部免疫微环境发挥重要调控作用,可诱导大量趋化因子如CXCL10、CXCL16分泌,通过与受体CXCR3、CXCR6结合介导CD8~+T细胞向皮肤迁移,最终导致黑素细胞特异损伤。然而,角质形成细胞在氧化应激下如何调控趋化信号介导CD8~+T细胞迁移,以及对CD8~+T细胞其他免疫功能的影响,仍有待进一步阐明。NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC及pro-caspase-1组成的复合物,是天然免疫系统的重要组成部分,活化后诱导促炎因子IL-1β、IL-18的成熟与释放。越来越多的研究证实NLRP3炎症小体活化可诱导趋化因子分泌从而介导免疫细胞组织定向迁移,还可调控免疫细胞增殖、活化等过程,在多种自身免疫性疾病的启动阶段发挥重要作用。最近有学者提出NLRP3炎症炎症小体参与白癜风发病,但其在白癜风中的具体功能作用及激活机制,尚不清楚。研究证实,线粒体氧化应激是促进NLRP3向线粒体转位并激活NLRP3炎症小体的重要和必要因素。进一步发现,NLRP3炎症小体组装依赖胞内钙信号,细胞膜上钙通道开放介导胞内钙超载,促进Ca~(2+)内流至线粒体,是导致线粒体损伤、NLRP3炎症小体活化的关键机制。最新文献发现,氧化应激敏感的TRPM2通道,介导Ca~(2+)内流,是线粒体氧化应激产生的重要机制,也参与调控氧化应激诱导的趋化因子表达、免疫细胞迁移等免疫过程。由此我们提出假说:白癜风患者角质形成细胞在氧化应激下,TRPM2钙通道开放介导Ca~(2+)内流,诱导线粒体损伤,很可能是活化NLRP3炎症小体的重要机制,NLRP3炎症小体活化可能参与调控角质形成细胞趋化因子表达、免疫细胞皮肤迁移等异常免疫反应,最终导致黑素细胞破坏及白斑形成。目的:研究白癜风患者表皮氧化应激活化角质形成细胞NLRP3炎症小体的机制,并阐明NLRP3炎症小体活化对白癜风CD8~+T细胞皮肤迁移及免疫效应的调控作用。方法:1.采用免疫组化鉴定白癜风皮损区NLRP3等炎症小体表达情况,ELISA检测白癜风患者外周血IL-1β的表达及治疗前后变化,并采用real-time PCR检测皮损区IL-1β表达并分析其与H_2O_2蓄积、趋化因子CXCL10、CXCL16表达的关系。2.在原代角质形成细胞中,模拟体内氧化应激环境,采用流式检测线粒体ROS生成、线粒体膜电位变化;采用real-time PCR、Western Blot、细胞免疫荧光、ELISA等鉴定NLRP3表达、定位以及活化情况,明确氧化应激对角质形成细胞中NLRP3炎症小体的激活作用。3.在原代角质形成细胞中,模拟体内氧化应激环境,Western Blot检测TRPM2表达,采用Fluo-4探针检测Ca~(2+)内流情况;在体外Ha Ca T细胞中转染TRPM2 Si RNA干涉TRPM2表达,检测Ca~(2+)内流、线粒体损伤及NLRP3炎症小体活化的各项指标,明确TRPM2介导的Ca~(2+)内流是否为线粒体氧化应激活化NLRP3炎症小体所必需。4.在Ha Ca T细胞中,采用Si RNA干涉Ha Ca T细胞中TRPM2、NLRP3表达,结合IL-1β中和抗体及IL-1R受体阻滞剂,ELISA检测Ha Ca T细胞中趋化因子CXCL10及CXCL16的分泌,阐明角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体对趋化因子表达的影响及机制。5.分选进展期白癜风患者外周血CD8~+T细胞,给予干涉TRPM2、NLRP3或中和IL-1β的Ha Ca T上清刺激处理,或阻断CD8~+T细胞表面IL-1R,采用流式细胞数检测CD8~+T细胞表面趋化因子受体CXCR3、CXCR6表达,明确角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体对CD8~+T细胞表面趋化因子受体表达的影响。6.分选进展期白癜风患者外周血CD8~+T细胞,利用Transwell实验,检测干涉TRPM2、NLRP3的Ha Ca T上清对白癜风患者CD8~+T细胞的迁移作用;并结合人重组趋化因子CXCL10、CXCL16试剂进行回复实验,或流式分选消除CD8~+T细胞上CXCR3及CXCR6表达,进行趋化实验,明确TRPM2活化的NLRP3炎症小体是否通过调控CXCL10-CXCR3及CXCL16-CXCR6信号影响白癜风CD8~+T细胞迁移。7.分选进展期白癜风患者外周血CD8~+T细胞,给予干涉TRPM2、NLRP3的Ha Ca T上清刺激处理,流式检测CD8~+T细胞分泌效应分子IFN-γ的能力,分析TRPM2活化的NLRP3炎症小体对白癜风CD8~+T细胞免疫效应功能的调控作用。结果:1.免疫组化检测白癜风皮损周组织中NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2的表达,发现以NLRP3上调最明显,且主要表达于角质形成细胞。ELISA结果显示,进展期白癜风患者外周血IL-1β(5.617±0.174 pg/m L,n=30)较健康对照(6.821±0.367 pg/m L,n=18)显著下调(P0.01);采用标准疗法治疗2月后,外周IL-1β水平较治疗前无明显变化(n=30,P=0.7154)。但在白癜风皮损周,IL-1βm RNA水平显著上调2.04±0.28倍(P0.01),并与皮损局部高浓度的H_2O_2(r=0.6588,P=0.0055)、以及上调的CXCL10(r=0.6118,P=0.0118)、CXCL16(r=0.5853,P=0.0172)m RNA水平均呈正相关。2.在原代角质形成细胞中,H_2O_2可呈剂量依赖方式诱导线粒体膜电位下降,促进线粒体ROS蓄积,导致线粒体损伤。此外,H_2O_2可显著上调NLRP3 m RNA及蛋白水平,促进NLRP3及其接头分子ASC向线粒体转位,诱导NLRP3炎症小体中Caspase-1及IL-1β的剪切成熟,同时效应分子IL-1β表达显著增加。表明H_2O_2可激活角质形成细胞中NLRP3炎症小体。3.在原代角质形成细胞中,H_2O_2可诱导TRPM2表达上调,显著促进Ca~(2+)内流;而转染TRPM2 Si RNA后,可显著抑制H_2O_2诱导的Ca~(2+)内流、线粒体膜电位下降及ROS生成;同时H_2O_2诱导的NLRP3、ASC线粒体转位及Caspase-1、IL-1β的剪切也被阻断。表明TRPM2介导的Ca~(2+)内流是氧化应激活化NLRP3炎症小体所必需。4.干涉Ha Ca T细胞中TRPM2、NLRP3表达显著降低Ha Ca T细胞中氧化应激诱导的趋化因子CXCL10、CXCL16分泌,以干涉TRPM2最为显著;此外,利用IL-1β中和抗体及IL-1R受体阻滞剂阻断IL-1β/IL-R信号,也可抑制氧化应激诱导的CXCL10、CXCL16表达。表明角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体参与调控其自身分泌趋化因子,且至少部分是通过IL-1β/IL-R信号调控的。5.分选进展期白癜风患者外周CD8~+T细胞,流式检测发现Ha Ca T细胞氧化应激模型上清可以显著诱导CD8~+T细胞表面趋化标志CXCR3、CXCR6表达,而予以干涉了TRPM2、NLRP3的Ha Ca T细胞氧化应激模型上清处理后,相比未干涉组CXCR3、CXCR6表达均下调;此外,中和Ha Ca T细胞氧化应激模型中IL-1β或阻断CD8~+T细胞表面IL-1R也有类似效果。表明角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体也可调控CD8~+T细胞表面趋化因子受体表达,并且是依赖IL-1β/IL-R信号的。6.利用Transwell模型研究Ha Ca T细胞上清对白癜风CD8~+T细胞的迁移,发现干涉TRPM2、NLRP3的Ha Ca T氧化应激模型上清对进展期白癜风患者CD8~+T细胞的迁移能力显著下降,而加入人重组趋化因子rh CXCL10、rh CXCL16进行回复实验,发现CD8~+T细胞趋化能力显著上调。此外,消除白癜风患者CD8~+T细胞上CXCR3、CXCR6表达均会影响其迁移。该部分研究证实角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体通过CXCL10-CXCR3、CXCL16-CXCR6信号调控白癜风CD8~+T细胞迁移。7.分选进展期白癜风患者外周CD8~+T细胞,流式检测发现Ha Ca T细胞氧化应激模型可以显著诱导CD8~+T细胞表达IFN-γ,而干涉了TRPM2、NLRP3的Ha Ca T细胞上清处理CD8~+T细胞后,相比未干涉组其IFN-γ表达显著减少。表明TRPM2活化的NLRP3炎症小体对白癜风CD8~+T细胞表达IFN-γ、发挥免疫效应起关键调控作用。结论:通过本课题研究,我们首次明确氧化应激条件下,角质形成细胞中TRPM2介导Ca~(2+)内流,诱导线粒体损伤,从而活化NLRP3炎症小体的具体机制;并率先揭示了TRPM2活化的NLRP3炎症小体通过调控趋化因子CXCL10、CXCL16分泌、以及CD8~+T细胞表面CXCR3、CXCR6的表达影响白癜风CD8~+T细胞皮肤迁移;此外还发现角质形成细胞中TRPM2活化的NLRP3炎症小体可以促进白癜风CD8~+T细胞分泌效应分子IFN-γ,参与白癜风发生及进展。本研究首次证实NLRP3炎症小体在氧化应激诱导的CD8~+T细胞特异免疫应答中发挥关键桥梁作用,为氧化应激启动自身免疫反应的机制提供了新证据,也为临床治疗提供了新思路和靶点。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R758.41

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