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《第四军医大学》 2017年
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氧化应激诱导自噬在白癜风发病中的作用及机制研究

何渊民  
【摘要】:背景:白癜风是临床常见的皮肤黏膜色素脱失性疾病,本病皮损多发生在曝光部位,重者可造成损容性表现,严重影响患者的身心健康。白癜风发病的具体机制目前尚不清楚,但造成本病发生的最终环节已经证实为患者皮损局部黑素细胞被破坏。新近研究证实,黑素细胞氧化应激状态是导致白癜风患者表皮黑素细胞破坏的关键因素。黑素细胞在受到内外环境刺激导致的氧化应激状态时,细胞内过量的氧自由基可以干扰细胞的正常生理代谢、增殖和分化,并会进一步诱发机体针对自身黑素细胞的免疫反应,导致黑素细胞出现不可逆性损伤。既往研究发现白癜风患者黑素细胞较正常人更易受到氧化氧化应激,但其中的具体机制尚未阐明。因此,明确白癜风患者黑素细胞易受氧化应激的具体机制对于阐明白癜风发病的具体分子机制、提供针对性的临床精准治疗靶点具有极其重要的意义。细胞自噬是真核生物细胞内降解聚集蛋白、受损细胞器及外源微生物等的一种保守的生物学现象。既往研究指出细胞处于氧化应激时胞内增高的ROS可以通过多种信号途径激活细胞自噬,保护细胞免受氧化损伤。Nrf2-ARE通路已被证实是黑素细胞在氧化应激时被激活的关键抗氧化通路,氧化应激时胞内增高的ROS可促进蛋白Nrf2转移入核,与细胞内多种II相解毒酶和抗氧化分子基因启动子区域的ARE结合,从而转录促进其表达以发挥对抗氧化损伤的作用。新近研究指出:自噬过程中关键蛋白p62启动子区的同样有ARE结合位点,Nrf2可入核与p62启动子区域ARE结合,上调其表达,从而参与细胞自噬完成。我们课题组既往已经证实白癜风黑素细胞存在Nrf2-ARE通路异常,由此,我们提出如下的假说:氧化应激状态下,正常黑素细胞内ROS可通过激活Nrf2-P62通路促进细胞自噬,保护黑素细胞抵抗氧化损伤。而白癜风黑素细胞存在ROS激活Nrf2-P62通路异常,导致细胞自噬水平激活障碍,使白癜风黑素细胞易受氧化损伤。目的:1.明确氧化应激时细胞自噬在正常人黑素细胞抗氧化损伤中的作用;2.分析氧化应激时白癜风黑素细胞自噬水平与正常人黑素细胞间的差异及其作用;3.揭示氧化应激时Nrf2-p62通路对正常黑素细胞及白癜风黑素细胞自噬的调控差异及其机制。方法:1.以不同浓度H_2O_2处理正常人黑素细胞系PIG1,CCK8法检测细胞活性,确定最佳的体外黑素细胞氧化应激模型;2.H_2O_2处理细胞不同时间,以免疫印迹、透射电镜及激光共聚焦显微镜检测正常人原代黑素细胞、正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V细胞自噬的水平;3.H_2O_2、自噬抑制剂及自噬促进剂处理细胞后,以流式细胞技术检测正常人原代黑素细胞、正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V细胞凋亡、线粒体膜电位及胞内ROS的变化情况。4.分别以Nrf2、p62干涉片段或过表达质粒转染正常人黑素细胞系PIG1及白癜风患者黑素细胞系PIG3V,再予以H_2O_2处理细胞后,以免疫印迹、Real-time PCR和激光共聚焦显微镜检测细胞自噬水平变化。5.分别以Nrf2干涉片段及p62过表达质粒转染白癜风患者黑素细胞系PIG3V,再予以H_2O_2处理细胞后,以流式细胞技术、免疫印迹和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡、线粒体膜电位、胞内ROS及细胞自噬水平变化。结果:1.体外培养的正常人原代黑素细胞及正常人黑素细胞系PIG1在H_2O_2作用下细胞活性呈浓度依赖性降低,0.5 mM H_2O_2处理细胞24 h可建立最佳的体外黑素细胞氧化应激模型;2.H_2O_2作用细胞一段时间内可呈时间依赖性显著刺激正常人原代黑素细胞及正常人黑素细胞系PIG1中自噬相关蛋白LC3II/I表达比值升高,细胞自噬溶酶体数量增多;3.自噬促进剂雷帕霉素预处理正常人原代黑素细胞及正常人黑素细胞系PIG1细胞后,可显著降低两种细胞在H_2O_2作用后的细胞凋亡比例及胞内ROS水平,显著提高两种细胞在H_2O_2作用后的细胞线粒体膜电位水平。自噬抑制剂氯喹预处理正常人原代黑素细胞及正常人黑素细胞系PIG1细胞后,可显著增高两种细胞在H_2O_2作用后的细胞凋亡比例及胞内ROS水平,显著降低两种细胞在H_2O_2作用后的细胞线粒体膜电位水平;4.H_2O_2作用正常人黑素细胞系PIG1一定时间后,细胞内自噬相关蛋白LC3II/I表达比值及自噬溶酶体数量显著高于H_2O_2作用白癜风患者黑素细胞系PIG3V后。同时H_2O_2作用正常人黑素细胞系PIG1一定时间后,细胞凋亡比例及胞内ROS水平显著低于H_2O_2作用白癜风患者黑素细胞系PIG3V后,细胞线粒体膜电位水平显著高于H_2O_2作用白癜风患者黑素细胞系PIG3V后;5.敲低正常人黑素细胞系PIG1中蛋白Nrf2表达后,H_2O_2诱导的细胞内自噬相关蛋白LC3II/I表达比值、蛋白p62水平及自噬溶酶体数量显著低于转染空白对照组。敲低正常人黑素细胞系PIG1中蛋白p62表达后,H_2O_2诱导的细胞内自噬相关蛋白LC3II/I表达比值及自噬溶酶体数量显著低于转染空白对照组。在敲低蛋白Nrf2的正常人黑素细胞系PIG1中过表达蛋白p62,H_2O_2诱导的细胞内自噬相关蛋白LC3II/I表达比值及自噬溶酶体数量显著高于单纯敲低蛋白Nrf2的正常人黑素细胞系PIG1组;6.以氯喹预处理细胞以抑制胞内蛋白经自噬降解后,H_2O_2作用细胞不同时间段,正常人黑素细胞系PIG1细胞内蛋白Nrf2及P62的表达显著高于白癜风患者黑素细胞系PIG3V,正常人黑素细胞系PIG1细胞核内蛋白Nrf2表达显著高于白癜风患者黑素细胞系PIG3V;7.在白癜风患者黑素细胞系PIG3V中过表达蛋白p62,H_2O_2诱导的细胞内自噬相关蛋白LC3II/I比值及自噬溶酶体数量显著高于白癜风患者黑素细胞系PIG3V的转染空白对照组。在白癜风患者黑素细胞系PIG3V中过表达蛋白p62,H_2O_2作用后的细胞凋亡比例及胞内ROS水平显著低于白癜风患者黑素细胞系PIG3V的转染空白对照组,细胞线粒体膜电位水平显著高于白癜风患者黑素细胞系PIG3V的转染空白对照组。结论:通过本研究,我们首次明确了氧化应激可促进正常人黑素细胞中细胞自噬水平升高,氧化应激诱导的细胞自噬水平升高可以保护黑素细胞抵抗氧化损伤。在此基础上,我们还进一步解析了Nrf2-p62信号通路调控氧化应激诱导的正常人黑素细胞自噬水平变化的机制,揭示了Nrf2-p62信号通路的激活障碍是白癜风患者黑素细胞更易出现氧化损伤的原因。本研究进一步完善了白癜风氧化应激发病机制的具体环节,并且将可能为白癜风的临床治疗提供新的思路。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R758.41

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