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《第四军医大学》 2017年
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汞诱导肝肾损伤机制及芦丁的保护作用

李晓红  
【摘要】:【背景】经济的不断发展,给人们带来方便的同时,也导致环境污染问题日益严重,环境污染正在危害全人类的健康,其造成的健康影响已经成为全世界范围内的重大公共卫生问题之一。环境污染物种类很多,重金属就是其中一大类,如汞、铅、镉等。目前认为氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、凋亡等与重金属引起机体多个脏器损伤的发病机制密切相关。很多研究已经发现汞及其化合物可通过氧化应激、炎症等对机体肾、肝和神经系统造成损伤。目前对汞诱导的肝损伤并无特效的预防治疗方法。很多研究报道,一些具有抗氧化作用的物质,如维生素E、硒、NAC、槲皮素等,可通过抑制氧化应激对氯化汞(HgCl_2)诱导的肝损伤发挥一定保护作用,提示氧化还原平衡稳态失调导致氧化应激可能是汞中毒损伤的主要机制。芦丁,作为一种重要的、人们生活中接触较多的类黄酮类物质,具有多种生理、药理功能,如抗惊厥、抗抑郁、抗菌、抗炎、抗氧化等作用。大量文献和研究提示,芦丁对STZ诱导的糖尿病具有治疗作用;对多种毒物诱导的胃肠道损伤也具有辅助治疗和预防的作用;对CCl4、乙醇诱导的肝损伤具有保护作用。芦丁可以通过抑制脂质聚集,增强AMPK的活性,增强PPARα的表达和抗氧化酶的活性发挥保肝作用。芦丁可以通过增强PC12细胞中的PI3k/AKT/mTOR和ERK1/2的磷酸化水平发挥对SNP诱导损伤的保护作用;芦丁可以通过激活MAPK信号通路及BDNF基因表达发挥对β淀粉酶诱导神经损伤的保护作用。那么,芦丁对HgCl_2诱导的肝肾损伤有没有保护作用呢?MAPKs和PI3k/Akt信号通路是调节细胞增殖、凋亡过程非常重要的分子通路,在芦丁对HgCl_2诱导肝肾损伤的保护作用中发挥什么样的功能呢?本研究明确了HgCl_2可诱导机体肝肾损伤,并结合芦丁本身具有的抗氧化、抗炎作用、保肝作用,探索芦丁对HgCl_2诱导肝肾损伤的预防作用及其相关机制,明确PI3k/Akt,MAPKs信号通路在芦丁发挥保护作用过程中的功能。综上所述,面对目前严重的环境污染及人们日常生活中接触低剂量汞的现实状况,芦丁作为一种人们生活中接触频繁的抗氧化物质,会对HgCl_2导致的肝肾损伤起到一定的预防和保护作用。【目的】1、探讨HgCl_2诱导的肝、肾损伤特点,明确HgCl_2诱导肝肾损伤的机制;2、探讨汞诱导肝、肾损伤以及芦丁发挥保护作用过程中ERK和Akt信号分子的作用;3、探索HgCl_2诱导肝细胞损伤的剂量效应以及芦丁的剂量依赖性保护作用;4、明确芦丁发挥保护作用过程中,ERK、Akt磷酸化与凋亡、氧化应激的关系。【方法】1、芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导肝损伤保护作用的体内实验:实验大鼠为为正常组、Rutin组、HgCl_2染毒组、HgCl_~(2+)Rutin组,实验开始前适应性喂养3天。第4天起(1)正常组:早8时腹腔注射生理盐水约2ml,第5-7天每天早8时灌胃给予含5%DMSO的生理盐水。(2)Rutin组:早8时腹腔注射生理盐水约2ml,第5-7天每天早8时,灌胃给予芦丁溶液(150mg/kg)。(3)HgCl_2组:早8时腹腔注射HgCl_2盐溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8时灌胃给予含5%DMSO生理盐水。(4)HgCl_~(2+)Rutin组:早8时腹腔注射HgCl_2盐溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8时灌胃给予芦丁溶液(150mg/kg)。实验持续周期为4天。最后一次给予芦丁后,禁食约8小时后称量体重,腹腔注射苯巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后,打开腹腔抽取腹主动脉血,并去除肝脏、肾脏称重并记录。大生化仪检测血清ALT、AST、ALB等评价肝功能的指标。采用DHE探针检测肝冰冻切片ROS的水平,利用试剂盒检测肝组织GSSG含量和MDA水平评价氧化应激损伤。试剂盒检测肝CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot检测相关抗氧化蛋白表达水平,评价芦丁对HgCl_2导致肝抗氧化防御系统改变的影响。Western Blot检测凋亡家族蛋白表达水平,评价芦丁对HgCl_2诱导凋亡相关分子蛋白表达变化的影响。最后通过Western Blot检测Akt和Erk的磷酸化水平的变化。2、芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导肾损伤影响的体内实验:动物分组及处理同前。最后一次给药结束后,禁食8小时,称量动物体重,处死动物并称其肾重。血清UREA、CRE等肾功能的指标采用大生化仪检测。肾冰冻切片ROS的水平,采用DHE探针检测。利用试剂盒检测氧化应激损伤的指标,GSSG含量和MDA水平。试剂盒检测CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot检测相关抗氧化蛋白表达水平,评价芦丁对HgCl_2导致肾抗氧化防御系统改变的影响。Western Blot检测凋亡家族蛋白表达水平,评价芦丁对HgCl_2诱导肾细胞凋亡相关分子蛋白表达变化的影响。最后通过Western Blot检测Akt和Erk的磷酸化水平的变化。3、Hg~(2+)(HgCl_2)诱导肝损伤体外实验:L02细胞暴露于1-150μM的HgCl_2处理3、4、5、6、7、8小时,诱导肝细胞损伤。MTT检测细胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测肝细胞凋亡。采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。4、芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导肝细胞损伤保护作用的体外实验:实验分组:Con,Ru,HgCl_2,20μMRu+HgCl_2,40μMRu+HgCl_2,60μMRu+HgCl_2。L02细胞先给于不同浓度芦丁20μM、40μM、60μM,预处理12小时,再暴露于60μM的HgCl_2,处理6小时,观察芦丁的保护作用。MTT检测细胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测肝细胞凋亡。DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(MMP)。用活体细胞线粒体膜孔通道荧光检测试剂盒检测细胞线粒体膜孔通道活性(MPTP)。试剂盒检测GSSG含量和MDA水平,评价细胞氧化应激损伤。试剂盒检测CAT和T-SOD活力、GSH含量以及GSH/GSSG比值,Western Blot检测相关抗氧化蛋白表达,评价芦丁对HgCl_2诱导肝细胞抗氧化防御系统改变的影响。Western Blot检测凋亡家族蛋白表达,评价芦丁对HgCl_2诱导肝细胞内凋亡相关分子表达水平变化的影响。通过Western Blot检测Akt和Erk的磷酸化水平。使用PI3K和Erk的抑制剂LY294002和U0126后,MTT检测细胞活力,Western Blot检测相关抗氧化蛋白表达及凋亡家族蛋白表达水平,明确芦丁是通过激活Akt和Erk的磷酸化,增强抗氧化防御系统功能,抑制凋亡发生,发挥对HgCl_2导致肝细胞损伤的保护作用。【结果】1、芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导大鼠肝损伤有一定的保护作用。芦丁改善了HgCl_2导致的大鼠体重增加的减少、肝体比增加;改善了HgCl_2诱导的肝功能、氧化应激损伤;提高了相关抗氧化蛋白的表达以及抗氧化酶的含量与活力;改善了肝内细胞凋亡相关蛋白表达水平的改变;芦丁在一定程度上改善了HgCl_2导致的大鼠肝组织内ERK和Akt磷酸化水平的降低。2、芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导大鼠肾损伤有一定的保护作用。芦丁改善了HgCl_2导致的大鼠体重增加的减少、肾体比增加;改善了HgCl_2诱导的肾功能的改变、氧化应激损伤;提高了抗氧化蛋白的表达及抗氧化酶的含量与活力;改善了肾内细胞凋亡相关蛋白表达水平的改变;芦丁在一定程度上改善了HgCl_2导致的大鼠肾组织内ERK和Akt磷酸化水平的降低。3、Hg~(2+)(HgCl_2)处理L02细胞,在一定浓度范围内能剂量依赖性降低细胞活力下降,剂量依赖性导致细胞凋亡增加、活性氧水平升高,并建立良好的肝细胞损伤模型。4、芦丁预处理能够减轻Hg~(2+)(HgCl_2)诱导的肝细胞氧化应激水平。芦丁预处理能够改善HgCl_2导致的细胞活力降低,与HgCl_2损伤组相比,差异有统计学意义(P0.05);还可抑制HgCl_2导致的细胞内ROS的增加(P0.05);缓解CAT、GSH、T-SOD等的活性/含量的降低(P0.05);SOD2、CAT、Nrf2的蛋白表达水平升高,增强抗氧化防御系统功能。5、芦丁预处理能够抑制Hg~(2+)(HgCl_2)诱导的肝细胞凋亡。芦丁预处理显著抑制HgCl_2诱导的肝细胞凋亡,与HgCl_2组相比,差异有统计学意义(P0.05);芦丁预处理导致Bcl2的表达水平上升,Bax表达水平下降,Bax/Bcl2比值降低,与HgCl_2组相比,差异有统计学意义(P0.05),Caspase3表达水平也有所下降。6、芦丁预处理能够改善Hg~(2+)(HgCl_2)诱导的细胞线粒体功能障碍。芦丁预处理改善了HgCl_2诱导的细胞线粒体膜电位的下降和线粒体膜孔通道活性的降低。7、芦丁预处理改善了Hg~(2+)(HgCl_2)诱导的细胞内ERK和Akt磷酸化水平的降低。芦丁预处理后,肝细胞内ERK磷酸化水平与HgCl_2相比显著升高(P0.05),Akt磷酸化水平与HgCl_2组相比亦有所改善,但不显著。8、ERK抑制剂(U0126)和PI3K抑制剂(LY294002)可在一定程度上消除芦丁对Hg~(2+)(HgCl_2)诱导的肝细胞活力下降的改善作用。U0126、LY294002前处理细胞组,抗凋亡蛋白Bcl2表达降低,与芦丁预处理组相比,差异有统计学意义(P0.05),与HgCl_2组Bcl2的表达相当;BAX/Bcl2比值,与芦丁处理组相比显著提高,差异有统计学意义(P0.05)。用ERK和PI3K抑制剂前处理细胞组,SOD1、SOD2及CAT的蛋白表达水平与芦丁预处理相比有所降低,与HgCl_2组三类蛋白的表达水平基本一致。即芦丁可通过激活ERK、Akt信号分子磷酸化,增强抗氧化防御系统功能,抑制细胞凋亡,发挥对HgCl_2诱导的肝细胞损伤的保护作用。【结论】1、HgCl_2可破坏机体抗氧化防御系统,导致氧化应激、线粒体损伤,凋亡发生。2、HgCl_2可在一定程度上抑制ERK和Akt磷酸化,参与组织及细胞损伤。3、芦丁可增强抗氧化防御系统功能、减少ROS产生,提高抗氧化酶活性,减缓组织损伤及细胞凋亡。4、芦丁可能通过激活ERK和Akt磷酸化,增强抗氧化防御系统功能,缓解器官损伤及凋亡。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R114

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