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《第四军医大学》 2017年
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炎性环境下牙周膜成纤维细胞通过非折叠蛋白反应调控巨噬细胞极化的机制探索研究

王颖  
【摘要】:不利生存环境可以导致细胞内质网稳态发生改变,而细胞通过诱发非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)维持内质网稳态,防止细胞发生内质网相关的凋亡。在既往关于UPR与慢性牙周炎的相关性研究中,已经证实UPR标志性分子X盒结合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP-1)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)表达水平与牙周炎组织中炎症的破坏程度呈正相关[1];本课题组前期研究也已经证实炎症来源的牙周膜干细胞(P-PDLSC)中UPR被激活[2];但来自于慢性牙周炎组织的牙周膜成纤维细胞是否同样处于UPR状态尚无报道。牙周膜成纤维细胞是牙周膜中功能最重要的细胞,其最主要功能是参与细胞外基质的产生和代谢,同时也具有很多类似固有免疫细胞的功能,例如表达模式识别受体并识别病原体相关分子模式,分泌细胞因子及趋化因子,调节固有免疫及获得性免疫细胞的增殖、迁移和活化。炎症来源的牙周膜成纤维细胞如果也像P-PDLSC一样处于UPR状态,UPR对于其免疫功能会有怎样的影响?在牙周炎症发生发展过程中,巨噬细胞的M1/M2极化状态和细胞因子的分泌在病原体的清除及组织改建中均发挥着重要作用。M1型巨噬细胞分泌大量细胞因子促进炎症发展、促进破骨细胞分化、促进细胞外基质降解;M2型巨噬细胞则通过分泌对炎症有抑制作用的细胞因子及多种生长因子,抑制炎症反应,促进组织的修复和再生。在炎症发展的不同阶段M1、M2细胞的比例及功能亦不同,过度极化或者表型之间的转化障碍都将影响炎症的预后。既往关于HPDLF对于巨噬细胞的调控作用报道很多,但关于HPDLF的UPR状态是否参与细胞对于巨噬细胞极化的影响尚无报道。白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(LAIR-1)是表达于大部分免疫细胞表面的一种免疫抑制性受体,LAIR-1在经过单克隆抗体(m Ab)交联活化后,可传递强烈的抑制性信号。但关于LAIR-1与单核巨噬细胞极化的相关研究国内外尚无报道。LAIR-1已被证实与类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的发病有着密切的联系,并且可以抑制破骨细胞的破骨分化。牙周炎与RA有着相似的发病机制,胶原异常代谢、单核巨噬细胞的极化和破骨细胞的分化都在这两种疾病的发展中起到重要的作用。但目前尚无有关LAIR-1与牙周疾病的相关报道。鉴于此,本研究通过体外分离培养的正常及炎症来源的人牙周膜成纤维细胞,比较二者的UPR状态有无差异;应用UPR诱导剂TM、TG预处理HPDLF,探讨UPR状态的HPDLF对LPS的反应性有无变化,同时通过间接共培养检测其对于巨噬细胞极化的影响与正常细胞有无差异,并探索这种差异可能的分子机制。本研究主要分为以下三部分:第一部分:炎症微环境对HPDLF中UPR相关分子表达的影响【研究目的】1、比较UPR相关基因在健康来源的牙周膜成纤维细胞(H-HPDLF)和炎症来源的牙周膜成纤维细胞(P-HPDLF)中的表达差异;2、体外模拟牙周炎微环境,探讨牙周膜成纤维细胞UPR的可能诱因。【研究方法】1、通过实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析H-HPDLF和P-HPDLF中UPR相关基因GRP78、CHOP、XBP-1、XBP-1s、PERK、IRE-1、ATF-6 m RNA的表达差异。2、TNF-α(10ng/ml)、IL-1β(0.1ng/ml)、LPS(100ng/ml)分别作用HPDLF(作用时间为12、24、48h),q RT-PCR、蛋白质印迹法(Western Blot)检测HPDLF中UPR相关分子蛋白及m RNA的表达水平。【实验结果】证实体外分离培养的P-HPDLF中GRP78、CHOP、PERK、XBP-1s m RNA的表达水平明显高于H-HPDLF。与对照组相比,LPS、TNF-α、IL-1β分别作用HPDLF均可以明显增加GRP78、PERK、CHOP和XBP-1s m RNA的表达水平,同时增加GRP78、PERK、CHOP蛋白的表达水平。【结论】初步证实体外培养P-HPDLF中UPR处于活化状态;并首次证实LPS、TNF-α、IL-1β均可以体外诱导H-HPDLF发生UPR。第二部分UPR状态对HPDLF免疫相关功能的影响【研究目的】1、观察TLR4活化后的HPDLF对巨噬细胞极化是否具有调节功能;2、观察处于UPR状态的HPDLF促进巨噬细胞极化的功能是否受到影响;3、观察处于UPR状态的HPDLF细胞因子的分泌、表面模式识别受体TLR4/CD14的表达、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路的活化是否受到影响。【研究方法】1、LPS处理HPDLF后与THP-1共培养,通过流式细胞术检测THP-1表面CCR7、CD86、CD163、CD206及胞内IL-10、Arginase-1的表达水平变化,通过q RT-PCR检测巨噬细胞极化相关分子m RNA的表达水平变化;2、TM预处理HPDLF 6h,LPS处理HPDLF 12h后与THP-1或CD14免疫磁珠分选的外周血中的单核细胞进行共培养,通过流式细胞术检测极化相关分子的表达;3、TM预处理HPDLF 6h,LPS处理HPDLF 12h,ELISA检测细胞培养上清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的浓度;q RT-PCR检测细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA的表达水平;流式细胞术检测其表面CD14、TLR4的表达水平;Western Blot检测NF-κB通路活化情况。【实验结果】1、LPS处理HPDLF后与THP-1共培养,THP-1表面CCR7、CD86蛋白及m RNA表达水平显著增加,IL-1β、TNF-α、IL-12的m RNA表达水平均显著增高;IL-10及Arginase-1蛋白表达水平降低,CD163、CD206没有明显变化;2、TM、TG预处理HPDLF 6h后,与对照组相比,预处理组细胞促进巨噬细胞M1极化的功能受到抑制,表现为共培养体系中的THP-1、外周血CD14+单核细胞表面CCR7、CD86明显下降;3、经ELISA检测,TM、TG预处理的HPDLF对于LPS的免疫反应出现钝化,具体体现在细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8浓度降低,同时q RT-PCR结果显示上述四个分子的m RNA表达水平降低。4、流式细胞术检测显示LPS可以增加HPDLF表面TLR4的表达,但TM、TG预处理的HPDLF表面TLR4低于对照组。Western Blot结果显示TM预处理对于NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、I-κB及磷酸化I-κB没有影响,但可以减少由LPS所介导的NF-κB p65的表达增加及磷酸化水平增加。TG预处理具有一定增加NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65的能力(P0.01),但TG预处理可以抑制由LPS所介导NF-κB p65的增加以及NF-κB p65和I-κB的磷酸化。【结论】UPR状态的细胞对于LPS作用的反应性出现下降,表现在模式识别受体减少,炎性细胞因子分泌减少、炎症相关通路NF-κB的活化程度下降,同时UPR的活化对于HPDLF促进M1极化的功能起到一定限制作用。第三部分:UPR状态HPDLF对巨噬细胞表面抑制性分子LAIR-1表达的影响【研究目的】1、体外模拟牙周炎微环境,观察单核巨噬细胞表面LAIR-1分子的表达水平变化;2、检测LAIR-1分子对于细胞极化的影响。【研究方法】1、TNF-α(0.25ng/ml)、IL-1β(0.1ng/ml)、E.coli LPS(100ng/ml)、P.g LPS(100ng/ml)分别作用THP-1,流式细胞术检测细胞表面LAIR-1的表达水平;2、TM预处理HPDLF 6h,LPS处理HPDLF 12h后与THP-1,通过流式细胞术检测巨噬细胞表面LAIR-1分子的表达水平变化;3、单克隆抗体交联活化单核巨噬细胞表面LAIR-1分子,流式细胞术及q RT-PCR检测单核巨噬细胞M1及M2极化情况。【实验结果】1、流式细胞术检测显示:与对照组相比,TNF-α、IL-1β、E.coli LPS、P.g LPS均可以明显减少巨噬细胞表面LAIR-1的表达水平;经过E.coli LPS预处理的HPDLF与THP-1共同培养亦可减少巨噬细胞表面LAIR-1的表达水平;同对照组相比,与UPR状态HPDLF共同培养的巨噬细胞其表面LAIR-1表达水平得以部分恢复。2、单克隆抗体91C3可以交联活化单核巨噬细胞表面LAIR-1分子,流式细胞术检测显示:巨噬细胞表面由IFN-γ所诱导的CCR7、CD86的表达增加受到91C3交联活化的抑制,q RT-PCR结果显示CCR7、CD86、IL-1β、IL-6 m RNA的表达水平也受到明显抑制。流式细胞术检测显示:LAIR-1的交联活化对于IL-4所诱导M2极化相关分子CD163、CD206没有明显影响,但q RT-PCR结果则显示91C3增加了CD163及CD206的m RNA表达水平,对于IL-10、Arginase-1的m RNA表达水平没有影响。【结论】首次证明LAIR-1的交联活化可以明显抑制巨噬细胞M1极化,表现为细胞表面共刺激分子、趋化因子受体表达减少,同时炎性细胞因子的产生受到抑制。E.coli LPS、P.g LPS、TNF-α、IL-1β等与牙周炎发病相关致病因子及细胞因子都会造成巨噬细胞表面LAIR-1分子的表达急剧下降,与LPS处理过的HPDLF共培养也使得巨噬细胞表面LAIR-1的表达水平明显的下降。但UPR状态的HPDLF对于保持巨噬细胞表面LAIR-1分子的强度具有积极的意义,再次通过另一种机制解释了UPR对于炎症发展具有调节限制的作用。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R781.4

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