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《第四军医大学》 2017年
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电场诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的实验研究

刘珺  
【摘要】:目的晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)是白内障术后最常见的并发症。该过程被认为是手术启动了晶状体的异常损伤修复反应,进而诱发晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)在后囊膜上增生、移行,并出现上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和晶状体纤维再生。晶状体上皮损伤影响了晶状体自身独有的电流环路,产生伤口电位和电场,增加赤道部LECs的增殖。所以有人认为白内障手术破坏了晶状体正常的电流形式和内在的电场,使LECs失去晶状体原有电流及电场的调节作用,导致LECs发生EMT,这可能是PCO发生的部分原因。本实验通过建立电场对人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞的体外作用模型,观察电场对HLE-B3细胞的生物学效应,如凋亡、增生、形态及细胞周期的影响,并检测电场对HLE-B3细胞内EMT标志物表达的影响及电场诱导HLE-B3细胞发生EMT的作用机制。方法1)体外培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞,并根据文献描述建立电场对HLE-B3细胞的作用模型;将细胞分别暴露于电场强度为50-150mV/mm的电场中,显微照相系统记录电场作用前、作用6h、12h及24h的细胞图像;流式细胞仪检测各时间点细胞凋亡情况并选择合适的电压。电压为100mV/mm时,观察电场对HLE-B3细胞增生的影响;流式细胞仪测定细胞周期。2)运用qRT-PCR技术检测电场对HLE-B3细胞中EMT标志物E-cadherin、Vimentin及integrinβ1基因表达的影响;运用免疫荧光及Western blot实验检测电场对HLE-B3细胞中EMT标志物E-cadherin,Vimentin及integrinβ1蛋白表达的影响。3)分别加入integrinβ1抑制剂MAB1965和FAK抑制剂PF-573,228,观察HLE-B3细胞形态的变化及EMT标志物基因、蛋白表达的变化,进一步探明电场诱导LECs发生EMT与integrinβ1-FAK信号通路之间的关系。结果1)成功建立了电场对HLE-B3细胞的作用模型。50mV/mm的电场暴露组中,细胞形态未见明显变化。100mV/mm、150mV/mm的电场暴露中,细胞间隙增加,细胞胞体伸长、呈纺锤样,且细胞长轴转向垂直于场线的方向。流式细胞仪检测结果进一步显示,150mV/mm电场强度可诱导细胞发生凋亡。100mV/mm的电场暴露组中,细胞的增殖受到明显的抑制,表现为细胞周期由G1期向S期过渡的抑制。2)分别应用免疫荧光、qRT-PCR法和Western blot检测EF对EMT标志物表达的影响。qRT-PCR法、免疫荧光和Western blot实验结果显示:电场诱导HLE-B3细胞上皮标志物E-cadherin的基因和蛋白表达下调,间质细胞标志物Vimentin基因和蛋白表达上调。3)电场诱导HLE-B3细胞integrinβ1表达的上调和FAK的活化。电场联合integrinβ1抑制剂MAB1965作用HLE-B3细胞后,细胞形态未发生明显的改变,Western blot检测结果显示E-cadherin和Vimentin的蛋白表达与对照组相比,无明显的统计学差异(P0.05)。而电场联合FAK抑制剂PF-573,228作用后,细胞形态依旧出现在电场作用下伸长的趋势。Western blot检测结果显示E-cadherin蛋白表达下调、Vimentin蛋白表达上调,与对照组相比,有显著的统计学差异(P0.05)。结论1)100mV/mm的电场引起HLE-B3细胞发生EMT的形态学改变,并诱发细胞凋亡,抑制HLE-B3细胞的增殖,抑制其细胞周期由G1期向S期的过渡。2)电场诱导HLE-B3细胞发生EMT,该过程伴有integrinβ1和FAK的表达上调。3)integrinβ1-FAK信号通路至少部分的参与电场诱导HLE-B3细胞发生EMT的过程。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R779.6

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