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《第四军医大学》 2017年
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神经元—星形胶质可塑性在创伤后应激障碍中的作用

刘高华  
【摘要】:第一部分:FGF2调控星形胶质细胞GLAST在PTSD治疗中的作用及机制研究目的:FGF2是一种重要的具有神经元和星形胶质细胞活化作用的有丝分裂原。以往研究报道FGF2可以改善SPS后星形胶质细胞的失活,但是其作用的分子机制尚不明确。GLAST/GLT-1是与认知相关的表达在星形胶质细胞表面的重要谷氨酸转运体,参与调节细胞外谷氨酸浓度和神经元存活。本实验旨在探讨FGF2调控星形胶质细胞谷氨酸转运体GLAST和GLT-1、改善SPS模拟的PTSD样行为的作用及机制。研究方法:成年雄性SD大鼠(250-300g,8周龄)70只随机分为对照组(n=15),SPS(n=25),SPS+FGF2(n=15)以及SPS+FGF2+AG490(JAK/STAT抑制剂,n=15)组,SPS、经腹腔给予FGF2(20 mg/kg·day)和AG490(10 mg/kg·day)处理。SPS后第7天至第28天行恐惧行为测试,第7/14/28天行旷场和高架十字迷宫实验。行为学实验结束后取材进行高效液相色谱、免疫荧光染色和Western blot实验,检测脑脊液谷氨酸浓度、海马GFAP、GLT-1、GLAST、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3含量。离体海马星形胶质细胞给予FGF2(30 ng/m L)和AG490(50μM)处理48 h,Western blot和免疫荧光染色研究蛋白表达情况。研究结果:SPS组的大鼠在SPS7天和14天后与对照组相比,在环境恐惧记忆及条件恐惧记忆中的不动时间均显著延长(与对照组相比,P0.01)。在SPS14天后,SPS+FGF2组大鼠的条件恐惧及环境恐惧记忆不动时间均比SPS-14 day组显著缩短(P0.01)。该治疗效应被AG490阻断(与SPS+FGF2组相比,P0.05)。在旷场实验和高架十字迷宫实验中,FGF2显著改善了SPS大鼠诱导的焦虑样行为,具体表现为与对照组相比,SPS-7 day和-14day组大鼠旷场中央区运动距离和滞留时间缩短(P0.01),与SPS组相比,SPS+FGF2组大鼠的上述两指标延长(P0.01),与SPS+FGF2组相比,SPS+FGF2+AG490组旷场中央区运动距离(P0.05)和滞留时间(P0.01)均明显缩短;在高架十字迷宫中,与对照组相比,SPS大鼠开臂滞留时间百分比和进入次数百分比均减少(P0.01),与SPS组相比,SPS+FGF2组两项指标增加(P0.01),与SPS+FGF2组相比,SPS+FGF2+AG490组两项指标均明显缩短(P0.05)。HPLC实验和Western blot,免疫荧光染色分别用于检测脑脊液中谷氨酸的含量及海马谷氨酸转运体、JAK/STAT信号蛋白的表达。与对照组相比,SPS组大鼠脑脊液中谷氨酸浓度升高(P0.01),海马GFAP、GLAST及GLT-1表达降低(P0.01),同时p-JAK1、p-JAK2、及p-STAT3表达降低(P0.01);与SPS组相比,SPS+FGF2组脑脊液谷氨酸含量降低(P0.01),海马GFAP表达升高(P0.01),GLAST上调(P0.01),GLT-1表达增加(P0.05),同时p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表达升高(P0.01);AG490逆转了FGF2的分子生物学效应,与SPS+FGF2组相比,SPS+FGF2+AG490组脑脊液谷氨酸再次升高(P0.05),海马GFAP、GLAST、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3均降低(P0.05)。FGF2处理离体培养的星形胶质细胞GFAP、GLAST、GLT-1、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表达增加(与对照组相比,P0.05),AG490处理离体培养的星形胶质细胞上述分子表达减少(与对照组相比,P0.05),同时给予FGF2和AG490,星形胶质细胞上述分子表达不变。研究结论:本实验发现SPS会抑制星形胶质细胞的JAK/STAT通路活性,从而抑制星形胶质细胞谷氨酸转运体,进而引起谷氨酸稳态失衡,扰乱中枢神经系统兴奋性-抑制性神经传递的平衡,进而引起PTSD样症状;相反,FGF2通过激活星形胶质细胞JAK/STAT信号通路发挥治疗PTSD的作用。第二部分:Trk/ERK/CREB介导的神经元突触可塑性与NGF治疗PTSD作用机制研究研究目的:NGF是临床上广泛使用的一种神经营养因子,研究表明,PTSD患者存在NGF表达的异常。神经可塑性改变构成应激相关障碍共同的神经生物学基础。本实验在之前实验的基础上建立小鼠SPS动物模型,旨在研究NGF能否影响SPS诱导的PTSD样行为,改善SPS诱导的神经突触可塑性改变,及其潜在的分子机制:是否依赖于ERK/CREB信号通路的激活。研究方法:实验一:75只成年雄性C57小鼠随机分为对照组,SPS-3 day,SPS-7 day,SPS-14 day,SPS-28 day组(每组15只),检测p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin在不同静止期过后的表达。实验二:105只成年雄性C57小鼠随机分为对照组,SPS组以及SPS+0.3,SPS+1.0,SPS+3.0,SPS+10.0以及SPS+30.0(μg/kg·day NGF)剂量组(每组15只)。各组检测环境恐惧和条件恐惧不动时间,采用Western blot技术检测海马p-CREB的表达。实验三:60只成年雄性C57小鼠随机分为对照组,SPS-14 day组,SPS-14 day+生理盐水组,以及SPS-14 day+NGF(10μg/kg·day)组(每组15只),检测动物行为学、形态学改变以及p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synap等蛋白的表达情况。实验四:离体培养的海马神经元给予NGF(50 ng/m L)和PD98059(MEK1抑制剂,20μM)处理48 h,观察神经元形态和分子生物学改变。研究结果:与对照组相比,SPS诱导小鼠环境恐惧记忆和条件恐惧记忆实验不动时间延长(P0.01),NGF剂量依赖性地缩短恐惧记忆不动时间,其减轻环境恐惧记忆和条件恐惧记忆的半数有效剂量(effective dose 50%)分别为1.935μg/kg·day和1.873μg/kg·day。本实验参照临床上NGF的用药剂量、NGF处理SPS小鼠的剂量-效应曲线以及ED50,滴定NGF浓度为3.0μg/kg·day。3.0μg/kg·day NGF处理能够改善SPS诱导的焦虑样行为:在EPMT中,与对照组相比,SPS组的开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比减小,而闭臂进入次数百分比和闭臂滞留时间百分比增大(P0.01);与SPS组相比,SPS+NGF组的开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比增加(P0.01),闭臂进入次数百分比(P0.05)和闭臂滞留时间百分比减小(P0.01);在OFT,SPS组的中央区运动距离和滞留时间减少(与对照组相比,P0.01);与SPS组相比,SPS+NGF组的中央区运动距离和滞留时间增加(P0.05);对照组、SPS组和SPS+NGF组的总运动距离和速度差异无统计学意义,提示SPS和NGF对小鼠的运动功能无影响。Golgi染色结果显示,与对照组相比,SPS组小鼠海马神经元基树突和顶树突总长度缩短(P0.01),基树突和顶树突突起数目及分枝数目减少(P0.05),同时树突棘密度减少(P0.01);NGF逆转了SPS诱导的突触可塑性改变,与SPS组相比,SPS+NGF组小鼠海马神经元基树突和顶树突总长度延长(P0.05),基树突和顶树突突起数目及分枝数目增加(P0.05),同时树突棘密度增加(P0.01)。Western blot结果显示,与对照组相比,SPS组的海马p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin随着静止期的延长不断减少,在SPS-14 day降至最低水平(P0.05),选取14天为SPS后静止期,给予NGF处理后,上述蛋白表达恢复如常(与SPS组相比,P0.05)。离体实验进一步揭示了NGF对于神经可塑性和突触相关蛋白影响以及可能的分子机制:与对照组相比,NGF组的树突分枝数目及总长度显著增加(P0.01),PD98059组的树突分枝数目及总长度减少(P0.05);与PD98059组相比,NGF+PD98059组上述两项指标增加至正常水平(P0.05),说明NGF通过逆转PD98059对海马神经元ERK通路的抑制作用改善突触可塑性;与对照组相比,NGF组p-Trk,p-ERK,p-CREB,MAP2表达增加(P0.05),PD98059降低了海马神经元ERK和CREB的磷酸化水平及MAP2表达(与对照组相比,P0.05),该效应被NGF逆转(与PD98059组相比,P0.05)。研究结论:NGF通过激活海马ERK/CREB信号通路改善SPS诱导的突触可塑性损害,减轻PTSD样行为学改变。第三部分:PTEN/Akt通路介导的ACC神经元突触可塑性增强与r TMS治疗PTSD机制相关性研究研究目的:r TMS是一种新型的物理治疗手段,临床上正逐步推广用于精神疾病的治疗。我们前期的研究发现,r TMS有效缓解大鼠SPS处理诱导的PTSD动物模型的焦虑样行为,但是r TMS是否对其恐惧行为具有缓解作用以及r TMS治疗PTSD深层次的分子机制尚未探明。本实验立足于现有发现,结合临床影像学研究结果,观察了r TMS对SPS模型前扣带回(ACC)谷氨酸能神经传递及突触可塑性的影响,以及介导r TMS作用的分子生物学基础。研究方法:本实验首先研究了不同静止期(7day/14day)、高频r TMS(Hr TMS,15Hz)和低频r TMS(Lr TMS,1Hz)对SPS大鼠ACC谷氨酸受体表达的影响,60只成年雄性SD大鼠(250-300g,8周龄)随机分为对照组(r TMS假刺激,sham,n=12),SPS-7d组(n=12),SPS-14d组(n=12),SPS+Hr TMS(n=12)以及SPS+Lr TMS组(n=12),由于检测14 day静止期对谷氨酸受体表达影响最为显著,SPS处理7天静止期后给予r TMS连续处理7天(每天1次)。48只SD大鼠随机分为对照组、si PTEN组、bp V组、wortmannin组(每组12只),检测ACC区域PTEN和p-Akt表达。为了检测Hr TMS是否通过PTEN/Akt信号通路改善SPS处理后ACC谷氨酸受体表达、突触可塑性及行为学改变,96只SD大鼠随机分为sham(n=16),SPS(n=16),SPS+Hr TMS(n=16),SPS+Hr TMS+bp V(n=16),SPS+Hr TMS+si PTEN(n=16)及SPS+Hr TMS+wortmannin(Akt抑制剂,n=16)组。r TMS干预结束后进行OFT,EPMT,恐惧箱实验(fear conditioning test,FCT)以及前脉冲抑制实验(prepulse inhibition,PPI)。采用Western blot实验检测各组谷氨酸受体、PTEN、p-Akt、Akt等分子的表达;采用免疫荧光染色双标技术标记检测ACC神经元中NR2B、Glu R1及p-Akt表达。采用Golgi染色技术研究各组神经元突触可塑性的改变。研究结果:Western blot实验结果显示,与对照组相比,SPS-7d组、SPS-14d组SPS+Lr TMS组和SPS+Hr TMS组ACC中NR1、NR2A、NR2B、Glu R1、Glu R2、Glu R3及Glu R4表达降低(P0.05),与SPS-14d组相比,SPS+Hr TMS组上述分子表达增加(P0.01)。与对照组相比,SPS-7d组和SPS-14d组ACC区PTEN表达增加,p-Akt表达减少(P0.01),Hr TMS而非Lr TMS逆转了上述改变:与SPS-14d组相比,SPS+Hr TMS组PTEN表达减少,p-Akt表达增加(P0.05)。免疫荧光染色实验结果显示,与对照组相比,其他4组ACC中Glu R1及NR2B表达降低(P0.05),与SPS-14d组相比,SPS+Hr TMS组Glu R1及NR2B表达增加(P0.05)。Neu N染色进一步证实,受SPS和Hr TMS调控的p-Akt位于神经元中。定位注射给予bp V、si PTEN及wortmannin后,大鼠ACC区域神经元PTEN、p-Akt有相应的改变:与对照组相比,si PTEN组PTEN表达降低(P0.01),bp V和si PTEN组p-Akt升高(P0.01),wortmannin组p-Akt降低(P0.01)。在SPS、Hr TMS基础上给予bp V、si PTEN及wortmannin处理发现,si PTEN和bp V增强了Hr TMS的效应,而wortmannin阻断了Hr TMS的效应:与SPS+Hr TMS组相比,SPS+HTMS+si PTEN组和SPS+Hr TMS+bp V组p-Akt、NR2B、Glu R1表达增加(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin组p-Akt、NR2B、Glu R1表达降低(P0.01)。Golgi染色显示:与对照组相比,SPS组ACC神经元树突总长度、树突分枝数目、树突棘密度均减小(P0.01);与SPS组相比,SPS+Hr TMS组上述指标增加(P0.05);与SPS+Hr TMS组相比,SPS+Hr TMS+bp V组树突总长度、树突分枝数目、树突棘密度进一步增加(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin组顶树突树突总长度、树突分枝数目、顶树突和基树突树突棘密度均减小(P0.05)。FCT显示,与对照组相比,SPS组环境恐惧记忆及条件恐惧记忆实验不动时间延长(P0.01),与SPS组相比,SPS+Hr TMS组不动时间缩短(P0.05),与SPS+Hr TMS组相比,SPS+Hr TMS+bp V组不动时间缩短(P0.05)SPS+Hr TMS+wortmannin组不动时间延长(P0.05)。EPMT中,与对照组相比,SPS组开臂进入次数和开臂滞留时间百分比减少(P0.01),与SPS组对比,SPS+Hr TMS组上述指标增大(P0.05),与SPS+Hr TMS组对比,SPS+Hr TMS+bp V组开臂滞留时间百分比增大(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin组开臂进入次数和开臂滞留时间百分比减少(P0.05)。OFT中,与对照组相比,SPS组中央区运动距离和滞留时间百分比减少(P0.01),与SPS组对比,SPS+Hr TMS组上述指标增大(P0.05),与SPS+Hr TMS组对比,SPS+Hr TMS+bp V组中央区滞留时间百分比增大(P0.05),SPS+HrTMS+wortmannin组中央区运动距离和滞留时间百分比减少(P0.05)。PPI实验中,与对照组相比,SPS组PPI指数减小(P0.01),与SPS组对比,SPS+Hr TMS组PPI指数增大(P0.05),与SPS+Hr TMS组对比,SPS+Hr TMS+bp V组PPI指数增大(P0.05),SPS+Hr TMS+wortmannin组PPI指数减小(P0.05)。研究结论:本实验印证了先期工作证明的高频r TMS对SPS大鼠焦虑样行为的改善作用,同时发现高频r TMS通过激活ACC神经元PTEN/Akt信号通路增强谷氨酸能神经传递和突触可塑性,进而减轻SPS诱导的条件恐惧和环境恐惧记忆增强,改善PTSD样行为学改变。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R749.5

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