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《第四军医大学》 2017年
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组织蛋白酶K在牙体硬组织形成中的作用研究

姜涛  
【摘要】:组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)于1995年首先被发现存在于兔的破骨细胞中。早先的研究认为CTSK主要在破骨细胞中表达,并通过在酸性环境下降解Ⅰ型胶原、骨桥蛋白等骨基质蛋白参与破骨细胞介导的骨吸收。CTSK基因位于人类1号染色体,其突变将导致致密性成骨不全(pycnodysostosis)。其典型症状除骨密度增高、频发骨折、指/趾骨末端溶骨等骨骼异常之外,通常还会表现有牙釉质发育障碍、牙髓腔或根管闭锁以及牙骨质增厚等牙体硬组织异常,但其机制尚不清楚,甚至目前尚未见到CTSK在牙齿发育过程中表达模式及作用的研究报道。考虑到骨组织和牙体硬组织(牙釉质、牙本质和牙骨质)有着相似的成分及理化性质,在骨改建过程中发挥重要作用的CTSK有可能在牙体硬组织发育过程中亦发挥重要作用。本课题以研究CTSK在牙齿发育过程中的表达模式为切入点,利用体外降解实验寻找CTSK在牙齿发育过程中可能的作用底物,构建Ctsk基因敲除小鼠模型并分析其表型,并通过对CTSK基因突变临床病例的研究,来探索CTSK在牙体硬组织形成中的作用,为进一步研究其在牙齿发育中的作用机制奠定基础。研究方法:1)25只BALB/c小鼠(18天胎鼠和出生后1天、5天、10天、20天小鼠各5只),用1%戊巴比妥钠行腹腔内注射过量麻醉处死后解剖分离下颌骨,利用免疫组化染色观察下颌磨牙(牙胚)中CTSK的表达情况;2)利用釉基质蛋白(Emdogain,EMD)酶谱实验(考马斯亮蓝染色),检测不同p H值(p H=4.5、p H=5.5和p H=8)、不同反应时间(2 h、6 h、12 h、24 h、48 h)和不同CTSK浓度(上样量分别为0.015μg、0.045μg、0.075μg、0.105μg、0.15μg和0.225μg)条件下,CTSK对釉基质蛋白的降解能力;3)利用体外降解实验(银染色),检测不同酶/底物比和不同反应时间(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)条件下,CTSK对釉原蛋白(AMELX)的降解能力;4)委托上海南方模式生物科技发展有限公司,利用CRISPR/Cas9技术构建Ctsk基因敲除小鼠模型;5)利用体视显微镜和Micro CT初步观察Ctsk基因敲除小鼠下颌骨和牙齿的形态与结构;6)通过病史采集、体格检查、病理检查、X线检查、颌面部CBCT等检查和CTSK基因测序对1例致密性成骨不全患者进行临床研究和基因分析。研究结果:1)在小鼠磨牙牙胚发育过程中,从前成釉细胞到成熟晚期的成釉细胞均表达CTSK,表达强度呈弱-强-弱的变化;2)在牙本质矿化阶段的成牙本质细胞中可以检测到CTSK的强表达,并且这种表达一直持续到牙本质形成的晚期;3)通过EMD酶谱实验,发现在p H=4.5的酸性环境中,CTSK能够降解商品化的釉基质蛋白,其酶解能力随着作用时间和CTSK浓度的增加而增强;4)通过体外降解实验,发现CTSK可以将釉原蛋白裂解为多个产物,其酶解能力随着作用时间和CTSK浓度的增加而增强;5)成功构建了Ctsk-/-小鼠模型,为研究CTSK在牙齿发育中的作用及作用机制提供了实验工具;6)初步观察到Ctsk-/-小鼠磨牙有类似于成熟不全型釉质发育不全的表现,以及下颌第一磨牙髓室牙本质增厚、髓室局部闭锁等牙体硬组织异常表现;7)通过体格检查、影像学检查、病理检查等,发现该患者具有身材矮小、骨密度增高、锁骨发育异常、双手双脚短小、指甲发育异常、指/趾骨末端溶骨、额骨膨隆、颧面部塌陷、上下颌骨发育不良、下颌角变钝、腭穹隆消失、上颌牙列缺损、下颌牙列缺失、牙骨质增生、牙齿萌出异常、下颌颌骨骨髓炎等致密性成骨不全的典型症状;通过基因分析,明确了患者致密性成骨不全的诊断,发现了CTSK基因5号外显子上的两个复合杂合突变位点(p.Gly146Asp和p.Tyr203His)。研究结论:本课题首次发现了CTSK表达于小鼠磨牙牙体硬组织形成相关细胞,首次揭示了CTSK在小鼠磨牙发育过程中的时空表达模式及CTSK能够降解牙体硬组织特异性蛋白——釉原蛋白等釉基质蛋白的能力;成功构建了Ctsk-/-小鼠模型,为进一步研究CTSK在牙齿发育中的作用及作用机制提供了实验工具;并且首次观察到Ctsk-/-小鼠磨牙具有釉质发育不全、局部髓室闭锁等牙体硬组织异常表现。与此同时,我们再一次证实CTSK基因突变所致的致密性成骨不全患者表现有包括牙齿发育异常在内的多种牙齿相关表征。初步证实了CTSK在牙体硬组织形成过程中发挥作用,为进一步揭示CTSK在牙体硬组织形成过程中的作用机制、解释致密性成骨不全患者牙体硬组织异常的致病机理奠定基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R78

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