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《第四军医大学》 2017年
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联合拮抗IL-13及IL-25对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑抑制作用的研究

张方琪  
【摘要】:哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病,由气道自身结构细胞和炎症细胞及其细胞组分共同参与。哮喘患者气道反复炎症以及持续重塑促进了不可逆性的肺功能下降,增加了对当前哮喘治疗药物的抵抗。传统观点认为Th2占优势适应性免疫应答在哮喘发生发展中起关键作用。Th2型细胞因子IL-4、IL-5及IL-13等与其靶细胞相互作用导致哮喘典型病理生理改变;其中IL-13在哮喘的气道炎症、气道高反应以及重塑中的作用已经得到肯定,机制也日趋明确。但目前临床上有关靶向阻断IL-13的哮喘治疗策略并没有明确获益。究其原因,一方面,Th2类细胞因子的功能效应间存在相互代偿;另一方面,适应性免疫应答与固有免疫应答之间存在复杂的交互。气道上皮层不仅作为结构屏障,其还可以对环境刺激做出应答,分泌相应的炎症介质IL-25、IL-33和TSLP等,激活粘膜周围ILC2细胞进而导致哮喘的发生发展。固有免疫应答作用的发现为哮喘基于肺部的发病机制与Th2型炎症提供了一个紧密的联系;并一定程度解释了靶向阻断以Th2为中心的适应性免疫应答并不能最大临床获益的原因。尽管IL-25、IL-33和TSLP均能诱导哮喘的发生,IL-33主要病毒相关疾病中高表达、TSLP主要在毒性疾病(如吸烟)高表达,而IL-25在变应性哮喘中表达较高,且IL-25可以促进IL-33以及TSLP在肺部的表达,说明IL-25在变应性哮喘中的作用更为突出。基于此,我们设想联合阻断适应性及固有免疫应答的关键因子IL-13和IL-25,可能会更好的下调哮喘的气道炎症和气道重塑。为此,进行了以下研究:方法:1.OVA诱导哮喘小鼠模型,BALF中细胞计数,HE染色、Masson染色观察模型制备情况。2.Real-Time PC R检测哮喘模型小鼠肺组织IL-13和IL-25 mRNA的表达情况,ELISA检测BALF中IL-13和IL-25的蛋白表达水平,免疫组化染色对肺组织IL-13和IL-25进行定位。3.应用sIL-13R和s IL-25R靶向拮抗哮喘小鼠IL-13和IL-25后,BALF中细胞计数,肺组织HE染色,观察气道炎症的变化。以Mch诱导各组小鼠,观察气道高反应的变化。4.联合拮抗IL-13和IL-25后,ELISA检测BALF以及肺组织匀浆中Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13表达水平,以及固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的表达水平。5.肺组织PAS染色,ELISA检测BALF及肺组织中MUC5AC糖蛋白表达水平,来反映联合拮抗IL-13和IL-25后气道杯状细胞的化生和黏液分泌状态。6.天狼星红染色、胶原检测来观察支气管周围纤维化情况;Western blotting检测TGF-β1,Smad2以及p-Smad2的蛋白水平,分析拮抗IL-13和IL-25抑制胶原产生的机制。7.抗α-SMA和PCNA免疫组化染色,观察联合拮抗IL-13和IL-25对气道平滑肌细胞肥大和增殖的影响。8.抗vWF免疫组化染色,ELISA检测BALF及肺组织VEGF表达水平,观察联合拮抗IL-13和IL-25对肺组织新生血管的影响。结果:1.OVA成功诱导哮喘小鼠模型产生,哮喘模型BALF中嗜酸细胞增高、肺组织炎症浸润明显、气道周围纤维化显著。哮喘模型IL-13和IL-25的mRNA及蛋白表达水平均显著上调。2.应用sIL-13R和s IL-25R靶向拮抗哮喘小鼠IL-13和IL-25后,BALF中嗜酸细胞显著减少,肺组织炎症细胞浸润明显减轻,哮喘小鼠气道高反应明显控制。3.联合拮抗IL-13和IL-25后,BALF及肺组织匀浆中Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13以及固有免疫细胞因子IL-25、IL-33和TSLP的表达水平均显著下降。4.联合拮抗IL-13和IL-25后,哮喘小鼠MUC5AC糖蛋白表达明显抑制,气道PAS评分及杯状细胞area/Pbm比例明显下降。5.联合拮抗IL-13和IL-25后,TGF-β1及p-Smad2的蛋白水平明显下调,进而导致气道周围胶原的堆积明显减轻。6.抗α-SMA和PCNA免疫组化染色结果显示,联合拮抗IL-13和IL-25后气道平滑肌细胞肥大和增殖明显受到抑制。7.联合拮抗IL-13和IL-25后,VEGF表达水平明显下调,抗vWF阳性血管明显减少。结论:1.用OVA致敏和激发成功构建哮喘小鼠模型,该模型中IL-13及IL-25的mRNA及蛋白水平均显著高于正常对照小鼠。2.联合拮抗IL-13和IL-25可显著抑制过敏原诱导的气道嗜酸细胞炎症、气道高反应以及适应性和固有免疫应答的相关炎症因子水平。3.联合拮抗IL-13和IL-25可显著抑制过敏原诱导的气道黏液高分泌、细胞外基质沉积、气道平滑肌增厚以及肺组织血管新生从而抑制哮喘气道重塑。有望为临床治疗哮喘提供一种新思路。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R562.25

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