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《第四军医大学》 2017年
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锌指蛋白ZC3H12D在急性肺损伤中的作用和机制研究

王文辰  
【摘要】:研究背景:急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是致死性的呼吸系统危重症,可由多种肺内外致病因素诱发,具有发病率高、病死率高的特点。目前ALI/ARDS的分子机制还不明确,这对其诊断、预防和治疗造成了很大的限制。固有免疫介导的炎症激活在ALI/ARDS的病理过程中处于核心地位。各种致病因素启动炎症的级联放大作用,造成促炎-抗炎失衡是引起炎症反应过度激活的关键。ALI/ARDS中促炎-抗炎系统的调节机制也一直是研究的热点问题。具有CCCH锌指结构域的蛋白质12D(zinc finger CCCH domain-containing protein12d,ZC3H12D)是一种新发现锌指蛋白,在人体肺组织中高表达。ZC3H12D分子具有一个独特的锌指结构和一段脯氨酸富集区(Proline-rich region,PRR),具有潜在的RNA结合活性。研究发现ZC3H12D蛋白具有抑制肿瘤细胞增生的抗肿瘤作用以及抑制炎症通路活化的抗炎作用,并由NF-κB转录表达。但是目前其具体的作用机制还是未知。我们之前通过实验发现在ALI/ARDS时ZC3H12D的表达量发生了变化,这预示ZC3H12D蛋白可能参与了ALI/ARDS的炎症调节,但ZC3H12D分子在ALI/ARDS中发挥的作用及作用的靶点仍需我们进一步验证。研究目的:1.明确ZC3H12D是否参与LPS诱导的ALI;3.观察ZC3H12D在动物ALI模型中发挥的作用并探讨相应的机制;2.观察ZC3H12D分子抑制炎症反应的作用以及对肺泡上皮细胞的保护作用,并进一步探讨ZC3H12D蛋白抑制炎症的机制。研究意义:通过体内实验和离体实验,明确ZC3H12D分子在ALI的作用以及作用位点,完善ALI/ARDS的促炎-抗炎调节机制,为ALI的诊断和治疗提供新的证据和靶点。实验方法:第一部分:研究LPS诱导的ALI动物模型中ZC3H12D分子的表达情况1.建立动物模型。实验动物:雄性C57BL/6小鼠(20-25g)50只。使用气管滴注LPS(10mg/kg)的方法诱导小鼠ALI,并将小鼠随机分为五组:正常组(Control组),LPS致伤后2小时组(2h组),4小时组(4h组),8小时组(8h组),和12小时组(12h组),每组10只。在相应时间点检测小鼠肺组织渗透情况,肺湿干重比值以及促炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6含量,HE染色观察病理改变,观察NF-κB通路激活情况(免疫组织化学染色)。2.观察不同时间点ZC3H12D表达情况。q RT-PCR检测ZC3H12D m RNA相对表达水平,Western blot检测ZC3H12D的蛋白含量,免疫组织化学染色观察ZC3H12D的组织细胞定位。第二部分:观察过表达ZC3H12D对ALI的保护作用1.腺相关病毒气管滴注感染小鼠。C57BL/6小鼠(15-18g)随机分为正常组,ZC3H12D病毒组和GFP病毒组,每组20只。ZC3H12D病毒组和GFP病毒组分别气管滴注ZC3H12D腺相关病毒50ul(滴度1×1012)或GFP腺相关病毒50ul(滴度1.5×1012),滴注后缝合小鼠伤口继续饲养。3周后制作冰冻切片并用Western blot法检测ZC3H12D蛋白表达量。2.观察过表达ZC3H12D对ALI的保护作用。正常组,ZC3H12D病毒组和GFP病毒组每组随机抽出10只小鼠,分为LPS组、LPS+GFP组、LPS+ZC3H12D组、control组、GFP组和ZC3H12D组。LPS气管滴注致伤小鼠,12小时后检测小鼠肺泡灌洗液细胞数目、蛋白含量和LDH水平,检测肺湿干重比和肺组织MPO活性,检测TNF-α,IL-1β,IL-6促炎症因子含量,HE染色观察病理改变,免疫组织化学染色观察ZC3H12D组织细胞定位。Western blot检测肺组织i NOS、Cox2和ZC3H12D表达量以及NF-κB和AP-1通路激活情况。第三部分:体外研究ZC3H12D对LPS致伤肺泡上皮细胞损伤的保护作用及抗炎机制1.观察A549细胞中ZC3H12D表达情况。1)LPS刺激后不同时间点ZC3H12D表达情况:A549细胞分为六组:control组(正常组)、2h组、4h组、8h组、16h组和24h组。用LPS(25μg/ml)对A549细胞进行刺激,分别刺激2 h、4 h、8 h、16 h和24 h并用Western blot检测ZC3H12D蛋白表达量。2)不同剂量LPS刺激后ZC3H12D表达情况:A549细胞分为control组(正常组)、25μg/ml组、50μg/ml组和75μg/ml组。分别用25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml的LPS对细胞刺激2h或16h并用Western blot检测ZC3H12D蛋白表达量。2.观察过表达ZC3H12D对LPS诱导肺上皮细胞损伤的保护作用。A549细胞无血清无双抗饥饿处理2小时并分别用GFP质粒和ZC3H12D表达质粒进行转染。转然后继续培养24-48h。当两者转染效率在60%-70%时再分别加入50μg/ml LPS或等体积的PBS,并将细胞分为4组:control组(转染GFP质粒,用PBS刺激)、ZC3H12D组(转染ZC3H12D表达质粒,用PBS刺激)、LPS组(转染GFP质粒,用LPS刺激)和LPS+ZC3H12D组(转染GFP质粒,用LPS刺激)。6小时后收集培养液和细胞,检测细胞培养液中的TNFα、IL-1β和IL-6水平,Western blot检测细胞NF-κB和AP-1通路激活情况。A549细胞在分别转染GFP质粒和ZC3H12D表达质粒后接种于96孔板,分为4组:control组、ZC3H12D组、LPS+control组和LPS+ZC3H12D组。用LPS(100ug/ml)刺激A549细胞,孵育24h,采用CCK-8法测细胞生存率。3.研究ZC3H12D抑制炎症反应的作用机制。THP-1细胞接种于24孔板,分为3组:control组、sh ZC3H12D组和ZC3H12D组。分别用GFP质粒,ZC3H12D表达质粒和sh ZC3H12D慢病毒对细胞进行转染和感染。细胞转染和感染后用100ng/ml放线菌素D处理各组细胞。细胞于处理后1h、3h和6h行q RT-PCR,检测c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA相对表达量。研究结果:第一部分:研究LPS诱导的ALI动物模型中ZC3H12D分子的表达情况1.ALI动物模型的成功构建LPS致伤后小鼠肺泡灌洗液细胞增多(p0.05),肺组织严重水肿(p0.05),促炎症因子水平急剧升高(p0.05),并出现典型的ALI/ARDS病理改变,表明小鼠ALI/ARDS模型建立成功。同时小鼠肺组织病理改变显示肺损伤程度随着时间加重,8小时损伤最重(p0.05)。LPS滴注后NF-κB p65亚基出现了明显的核转位,表明NF-κB通路激活。2.在ALI动物肺组织中ZC3H12D表达呈先下降后上升的趋势上述动物模型中,ZC3H12D m RNA在致伤2小时表达最低,此后逐渐增多,致伤8小时其m RNA表达最多(p0.05);免疫组织化学染色发现ZC3H12D表达于小鼠肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞的胞浆中,ZC3H12D蛋白的表达量也在致伤2小时表达最低,同样在8小时达到最高(p0.05)。结果表明小鼠肺组织中ZC3H12D蛋白表达与肺组织损伤进程具有潜在的联系。第二部分:观察过表达ZC3H12D对ALI小鼠的保护作用1.验证在体利用腺相关病毒可有效过表达ZC3H12D分子冰冻切片显示小鼠肺组织有大量绿色荧光,显示感染成功。免疫组织化学染色和Western blot检测ZC3H12D表达情况。结果显示感染ZC3H12D腺相关病毒的小鼠肺组织中ZC3H12D过表达(p0.05)。2.在LPS诱导小鼠ALI的模型中,过表达ZC3H12D分子可有效降低肺组织损伤过表达ZC3H12D蛋白可以显著的改善肺组织渗透性(p0.05),减轻肺组水肿(p0.05)。肺组织MPO活性检测和肺泡灌洗液LDH检测发现过表达ZC3H12D可以有效地减轻肺组织损伤(p0.05)。病理观察也发现过表达ZC3H12D蛋白使小鼠肺组织损伤变轻,肺泡结构相对完整且炎症细胞浸润减少(p0.05)。3.过表达ZC3H12D分子对炎症因子表达的调控作用结果显示过表达ZC3H12D蛋白可以减少促炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6释放并减少肺组织i NOS和Cox2表达,Western blot检测也发现NF-κB和AP-1蛋白活化水平降低。表明过表达的ZC3H12D可以降低组织炎症因子分泌,抑制炎症通路激活,减轻组织炎症反应,改善肺组织损伤。第三部分:体外研究ZC3H12D对LPS诱导肺泡上皮细胞损伤的保护作用及抗炎机制1.LPS诱导体外培养肺泡上皮细胞损伤过程中ZC3H12D表达呈动态变化。1)LPS刺激2小时ZC3H12D表达量明显减少(p0.05),随后不断增加,并于16小时达到最高(p0.05)。2)不同剂量(25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml)LPS刺激A549细胞2小时后ZC3H12D的表达量均明显减少且呈LPS剂量依赖性(p0.05)。不同剂量(10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml)LPS刺激A549细胞16小时后ZC3H12D表达量均明显增加(p0.05),但之间没有差异。2.过表达ZC3H12D分子可减轻LPS诱导体外培养肺泡上皮细胞的损伤并降低相关炎症因子的表达随后我们观察了ZC3H12D对LPS致伤的A549细胞的保护作用。LPS刺激A549细胞后炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6的表达水平明显升高,NF-κB和AP-1也被激活(p0.05),过表达ZC3H12D蛋白可以显著降低炎症因子的表达以及NF-κB和AP-1活化(p0.05)。同时LPS刺激可以降低A549细胞的活力,使A549细胞生存率降低(p0.05),过表达ZC3H12D分子可以显著提升A549细胞的生存率,对细胞起到保护作用。3.ZC3H12D分子具有促进c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA水解的作用肺内巨噬细胞是炎症激活的始动细胞,在LPS刺激时可以产生大量炎症介质,激活其他炎症细胞引起炎症反应过度激活。因此最后我们使用单核巨噬细胞THP-1检测了ZC3H12D蛋白对c-fos、c-jun、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA稳定性的作用,结果显示ZC3H12D蛋白可以减弱c-fos、TNFα、IL-1β、IL-6和NF-κB p65m RNA稳定性,加速其降解,这表明ZC3H12D蛋白能通过抑制炎症因子生成抑制炎症反应。研究结论:1.内源性锌指蛋白ZC3H12D参与了ALI并和病程变化相关,是抗炎系统的一部分2.过表达的ZC3H12D可以降低炎症因子表达,抑制肺组织炎症反应并有效地减轻肺组织损伤。说明ZC3H12D是一种ALI保护性蛋白。3.ZC3H12D具有促进TNFα、IL-1β、IL-6、c-fos和NF-κB p65mRNA水解的功能,能通过抑制炎症应答对肺泡上皮细胞起到保护作用。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R563.8

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