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《第四军医大学》 2017年
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雌激素受体α309位点磷酸化对小鼠附睾管腔微环境的影响和机制

魏金花  
【摘要】:目的精子在附睾中获得运动和受精能力,其中管腔适宜的微环境对这一过程至关重要。雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)主要通过配体非依赖途径维持附睾管腔微环境的稳态。ERα敲除鼠表现为雄性不育,附睾管腔p H值升高,附睾尾部精子的数量和活力降低,输出小管和附睾管中与微环境相关的蛋白表达水平下降。人乳腺上皮细胞中,通过配体非依赖途径,ERα305位丝氨酸发生磷酸化,进而调节ERα靶基因的转录。据此我们推测,ERα305位点磷酸化有可能参与维持附睾管腔微环境的稳定。本研究通过构建与人ERαS305位点同位的ERαS309敲入小鼠,探讨ERα309磷酸化位点对附睾管腔微环境的影响及作用机制。方法1.基因测序验证ERαS309A敲入(S309AERKI)小鼠构建成功后,通过杂合型雌雄小鼠相互配对进行育种繁殖,将产生的子代提取基因组DNA,PCR和酶切鉴定基因型。2.通过雌雄交配实验观察雄性S309AERKI小鼠的生殖能力,计算机辅助分析技术检测S309AERKI小鼠附睾尾部精子数量和活力,揭示ERα309位点对生殖功能的影响。3.利用HE染色技术检测S309AERKI小鼠睾丸、输出小管和附睾形态变化,精密p H试纸检测S309AERKI小鼠附睾管腔p H值,放射免疫分析法检测S309AERKI小鼠血清睾酮含量变化,Western-blot和免疫组化检测ERα在S309AERKI小鼠睾丸、输出小管和附睾的表达,分析ERα309位点引起生殖功能改变的原因。4.通过Western-blot、实时定量PCR和免疫荧光染色检测附睾管腔微环境相关蛋白AQP9、CA12和NHE3在S309AERKI小鼠输出小管和附睾管的表达;并构建ERα-WT、ERα-S309A(组成性非磷酸化)和ERα-S309E(组成性磷酸化)表达载体,转染293T细胞,通过Western-blot检测ERαS309位点磷酸化对CA12和AQP9的影响,揭示ERα309位点引起生殖功能改变的分子机制。结果1.基因测序结果显示,小鼠的ERα309位点由原来的丝氨酸替换为丙氨酸,ERα309A敲入(S309AERKI)小鼠构建成功。2.S309AERKI雄性小鼠生育力下降,表现为雌鼠受孕率下降40%,平均每窝产仔数下降48.7%;附睾尾部精子数量无明显变化,但精子各级活力显著下降。3.S309AERKI雄性小鼠中,睾丸和附睾形态无改变,但输出小管管腔变大,管壁变薄;附睾管腔p H值在起始部、头部和尾部均升高;血清睾酮含量升高;ERα在睾丸、输出小管和附睾各段的表达没有改变。4.S309AERKI小鼠输出小管中,AQP9表达降低,CA12和NHE3没有明显变化;附睾管中,CA12表达降低,AQP9和NHE3没有明显改变。在转染表达载体的293T细胞中,ERα-S309A能减弱CA12和AQP9的表达,ERα-S309E能增强CA12和AQP9的表达。结论1.S309AERKI小鼠雄性生育力降低,附睾精子活力下降,表明ERα309位点的磷酸化影响雄性小鼠生殖功能。2.S309AERKI小鼠中,输出小管形态异常,附睾管腔p H值升高,睾丸和附睾形态无改变,ERα蛋白在输出小管和附睾管的表达无变化,血清睾酮含量升高,提示ERα309位点的磷酸化通过调节输出小管液体重吸收功能和维持附睾管腔酸性环境的稳定,影响精子在附睾中的成熟。3.S309AERKI小鼠输出小管中AQP9表达降低,附睾管中CA12表达降低;体外实验中,ERα-S309A能减弱AQP9和CA12的表达,ERα-S309E能增强AQP9和CA12表达,提示ERα309位点的磷酸化通过影响AQP9的表达来调节输出小管的液体重吸收,通过影响CA12的表达调节附睾管腔的酸性环境。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R339.21

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