收藏本站
《军事科学院》 2019年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

HepaRG和HepG2聚球体模型的建立及药物体外肝毒性检测的对比研究

孟镇锴  
【摘要】:目的安全性是药物研发领域最核心的基本原则,药物诱导性肝毒性是毒理学领域的研究重点。随着现代化工和制药技术的进步,人们开发化合物的速度越来越快,合成的数量越来越多,这便对于体外药物肝毒性筛选模型提出了更高要求,寻找并构建更加灵敏高效的体外模型意义重大。细胞体外三维(three-dimentional,3D)类组织聚球体培养作为近年来的研究热点,相比常规二维(two-dimentional,2D)细胞培养可以更好地模拟细胞和组织功能,提升建模效果。HepaRG和HepG2细胞的类组织聚球体模型在体外药物肝毒性的研究上应用较多,但针对性比较二者在形态学、生化功能、药物检测敏感度之间的差异的研究相对较少,选择何种模型进行体外肝毒性检测更加合适尚缺乏详细的研究。本课题拟对HepaRG和HepG2细胞进行体外3D细胞聚球体模型构建,对比研究二者在形态学、生长规律、功能蛋白表达、尿素代谢合成、糖原储存、体外药物肝毒性检测上的差异,为选择更加适合的体外药物肝毒性检测模型提供相关参考依据。方法在U形底低吸附96孔板中以100、200、400、800、1600个/孔的细胞密度对HepaRG和HepG2细胞进行体外三维聚球体模型的构建,记录接种后第3、7、10、14、21、28天的形态学变化,比较二者生长差异,探究最佳接种密度和时间节点;于接种后第7、10、14天对HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色,观察两模型内部细胞生长情况;利用实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)技术检测接种后第7、10、14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)的核受体、代谢I相酶、II相酶、转运体和白蛋白的mRNA的表达水平;利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)、Western蛋白质印记(Western blotting,WB)技术对接种后第10天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行检测,比较二者代谢I相酶、II相酶、转运体、白蛋白在蛋白水平的表达;对接种后第7、10、14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体(100个/孔密度组)进行氯化铵代谢实验,比较二者尿素生成水平差异;对接种后第10天的两细胞聚球体(100个/孔密度组)进行过碘酸-雪夫(periodic acid schiff stain,PAS)染色,观察二者糖原储存情况;选取14种药物(阳性对照药11种,阴性药3种)进行单次和重复剂量细胞毒性实验,检测细胞存活率并计算不同药物单次和重复给药下对两种细胞聚球体的半数抑制剂量(half maximal inhibitory concentration,IC_(50)),比较HepaRG和HepG2细胞聚球对药物肝毒性敏感度差异。结果两细胞聚球体直径随初始接种细胞密度的增大而增大,随培养天数增加体积不断增长,以100个/孔密度组模型满足直径参考范围较好,为最佳接种密度;HE染色显示第14天的HepaRG和HepG2细胞聚球体平均坏死直径分别116.2±13.4μm和200.2±44.3μm,HepaRG细胞聚球体坏死范围较小(P0.05);qRT-PCR结果显示HepaRG细胞聚球体多种蛋白的mRNA表达明显高于HepG2细胞聚球体(P0.05,P0.01),其接种后第7天有4种蛋白mRNA表达达峰值,第10天有9种达峰值,第14天有7种;IF结果显示HepaRG细胞聚球体多种功能蛋白在蛋白表达层面上均高于HepG2细胞聚球体(P0.05,P0.01);WB结果示HepaRG细胞聚球体的CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、GSTA1、GSTM1、UGT1A1、MRP2、ALB的表达水平分别为HepG2细胞聚球体的2.122、11.423、3.02、2.129、1.486、1.372、2.419、1.252、2.166、1.786倍;尿素检测结果显示HepaRG细胞聚球体相比同期HepG2细胞聚球体有更高的平均尿素生成水平(P0.01),HepaRG细胞聚球体尿素平均生成水平于接种后第7、10、14天分别为16.143±3.015、12.411±1.923和7.654±0.816 nmol/h·mm~3;PAS染色显示HepaRG和HepG2细胞聚球体均可储存和利用糖原;14种药物的细胞毒性实验结果显示,除3种免疫介导肝毒性的阳性药和3种阴性药外,其余8种阳性药均检测有明显肝细胞毒性,HepaRG细胞聚球体对药物毒性更加敏感,以重复给药下各药物显示的IC_(50)值最低,对乙酰氨基酚、苯溴马隆、非阿尿苷、丙戊酸、吲哚美辛、异烟肼、奈法唑酮、环磷酰胺的IC_(50)值分别为3.34 mM、0.35 mM、3.46mM、10.98 mM、6.32 mM、5.46 mM、1.37 mM、8.71 mM。结论HepaRG细胞类组织聚球体在直径控制、形态保持、功能蛋白表达、尿素代谢合成、药物肝毒性检测方面均较HepG2细胞聚球体更具优势,是更为合适的体外肝毒性评价模型。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R96

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 邓丽娟;李爱民;赵芯梅;王泽楠;燕群;罗晓蓓;林建华;张亚历;刘思德;;十二种人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究[J];胃肠病学和肝病学杂志;2013年01期
2 蒋黎;王宇明;;HepaRG细胞的生物学特点及其应用[J];肝脏;2010年05期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张飞媛;唐南洪;;基于生物人工肝细胞材料研究新进展[J];福建医科大学学报;2011年04期
2 ;Effect of artificial liver support system on patients with severe vira hepatitis:A study of four hundred cases[J];World Journal of Gastroenterology;2004年20期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李在村;;HAART相关的肝毒性[J];中国社区医师;2006年23期
2 罗永艾;王宠林;王正中;苗德林;;利福平和异菸肼的肝毒性实验研究[J];中国防痨通讯;1987年01期
3 陈重阳,姚铁钧,袁模军;甘草对小鼠扑热息痛肝毒性的保护作用[J];中国药理学通报;1988年02期
4 崔崑岷,姚宏,王荣媛,尚莉,韩宝龙;肝泰乐解异烟肼肝毒性的药理学研究[J];中国医院药学杂志;1988年02期
5 佟继明;;柴胡皂甙—d对苯巴比妥增强四氯化碳肝毒性的影响[J];承德医学院学报;1988年01期
6 Sherlock S;杨俊何;;药物引起的肝毒性[J];国外医药.合成药.生化药.制剂分册;1988年01期
7 钱宗涓;;含吡嗪酰胺抗痨治疗方案的肝毒性临床观察[J];铁道医学;1989年06期
8 王世俊;;利福平的肝毒性[J];中国药学杂志;1984年11期
9 苗玉发;康慧君;王超;张河战;;血清维生素D结合蛋白水平检测对大鼠肝毒性诊断的评价研究[J];现代检验医学杂志;2019年04期
10 张玉静;钟才高;;环境内分泌干扰物肝毒性研究进展[J];中国药理学与毒理学杂志;2018年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王秀娟;许利平;王敏;;常用中药及复方制剂的肝毒性[A];中华中医药学会第十二届内科肝胆病学术会议暨第四次国家中医肝病重点专科协作组学术会议论文汇编[C];2006年
2 葛帅;汤纳平;李华;马璟;;新技术在中药体外肝毒性评价中的应用[A];中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第二次(2017年)学术交流大会论文集[C];2017年
3 李朋彦;崔鹤蓉;李婷婷;柏兆方;王伽伯;肖小河;;基于3D培养技术的体外肝毒性评价模型研究进展[A];2016年第六届全国药物毒理学年会论文集[C];2016年
4 马喆;董冉冉;王萌;崔英;朱彦;;潜在肝毒性组分库的建立筛选与评价[A];2016年第六届全国药物毒理学年会论文集[C];2016年
5 金若敏;;中药肝毒性研究与评价[A];中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第二次(2017年)学术交流大会论文集[C];2017年
6 李晓宇;黄娜娜;孙蓉;;中药肝毒性发现策略与合理评价[A];2017年(第七届)药物毒理学年会论文集[C];2017年
7 林冬菊;王凯;彭缨;郑江;;基于赖氨酸和半胱氨酸的蛋白结合和黄独素-E乙酸酯肝毒性的相关性[A];2016年第六届全国药物毒理学年会论文集[C];2016年
8 周素芳;;正确认识中药肝毒性[A];中华中医药学会第二十二届全国脾胃病学术交流会暨2010年脾胃病诊疗新进展学习班论文汇编[C];2010年
9 江锋;荆志伟;;基于多个临床试验的中药肝毒性监测方法研究[A];第二十四次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2015年
10 张亚欣;王宇光;马增春;汤响林;梁乾德;谭洪玲;肖成荣;赵永红;高月;;薯蓣皂苷致肝毒性及其机制的初步研究[A];2015年(第五届)药物毒理学年会论文集[C];2015年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 上海中医药大学药物安全评价研究中心 金若敏;中药肝毒性?何须谈虎色变![N];上海中医药报;2019年
2 上海中医药大学附属曙光医院 上海中医药大学中医肝病研究所 胡义扬 刘成海;如何正确认识中草药肝毒性[N];上海中医药报;2017年
3 梅英;抗结核药物的肝毒性[N];中国医药报;2003年
4 董江萍;FDA与企业合作进行药品肝毒性预测研究[N];中国医药报;2005年
5 国家食品药品监督管理局药品审评中心 韩玲;肝毒性监测应贯穿于药物研发全程[N];中国医药报;2009年
6 阿胜;肝毒性 药物的致命伤[N];医药经济报;2004年
7 段文利;合并感染不影响抗艾药物疗效和肝毒性[N];中国医药报;2012年
8 本报记者 马丽亚;中医药肝病专家刘平教授:别把中药肝毒性夸大了[N];上海中医药报;2019年
9 记者 王晓冬;警惕酮康唑口服制剂严重肝毒性[N];中国医药报;2011年
10 记者 张东风;酮康唑口服制剂存在严重肝毒性[N];中国中医药报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周雷;基于代谢和转运的尼美舒利肝毒性机制及药物相互作用研究[D];中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所);2017年
2 余倩倩;苦参肝毒性组分苦参酮的体内外代谢研究[D];复旦大学;2013年
3 傅大干;丙戊酸肝毒性高危因素作用机理及其防治的实验研究[D];重庆医科大学;2004年
4 施畅;抗乙肝病毒药物Bay41-4109的肝毒性及其机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
5 廖艳;异烟肼与利福平肝毒性的代谢组学研究[D];四川大学;2005年
6 李胜彪;利用诱导多能干细胞研究丙戊酸诱发Alpers-Huttenlocher综合征肝毒性的机理[D];中国科学技术大学;2015年
7 沈冲;肝细胞凝胶包埋培养用于药物肝毒性的研究[D];浙江大学;2009年
8 朱庆;束缚应激加重对乙酰氨基酚肝毒性作用及其机制研究[D];南方医科大学;2014年
9 王加志;黄药子致肝毒性/配伍当归后减毒的亚细胞机制及毒性成分体外代谢研究[D];黑龙江中医药大学;2009年
10 马致洁;何首乌肝毒性客观性、临床标志物及损伤机制的初步研究[D];成都中医药大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孟镇锴;HepaRG和HepG2聚球体模型的建立及药物体外肝毒性检测的对比研究[D];军事科学院;2019年
2 Ran Tao;pH敏感型聚合物胶束缓解抗癌药物肝毒性的研究[D];天津大学;2018年
3 王姝;多指标细胞毒性检查方法及药物肝毒性的探索研究[D];北京中医药大学;2019年
4 阿卜杜米吉提·阿卜力孜;维药补骨脂的肝毒性及机制研究[D];新疆医科大学;2018年
5 刘娟;奥沙利铂肝毒性机制的初步探讨及还原型谷胱甘肽的护肝研究[D];广西医科大学;2015年
6 焦玉菡;基于多参数高内涵筛选的早期药物肝毒性研究[D];昆明理工大学;2018年
7 陈稳;基于集成学习的化合物肝毒性分类预测系统的设计与实现[D];辽宁大学;2018年
8 吴淇慧;中草药肝毒性预测模型的构建及其应用研究[D];广州中医药大学;2018年
9 布鲁根;石榴皮安石榴苷的制备及其亚急性毒性实验和肝毒性机制的初步研究[D];新疆医科大学;2017年
10 王璇;酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼肝毒性的相关研究[D];第三军医大学;2016年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026