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《军事科学院》 2019年
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哈氏弧菌AI-2型群体效应抑制剂的设计、合成及生物活性研究

袁波  
【摘要】:传统的抗生素疗法的发现及普及使得细菌感染性疾病的治疗得到改善,但是由于长期以来的抗生素疗法的滥用,造成细菌耐药情况严重,耐药菌分离率不断攀升,细菌感性疾病死亡率不断提高,世界卫生组织在2015年开始发起“世界提高抗生素认识周”,而2018年的主题是“很快就没有可用的抗生素了,我们急需做出改变”。因此抗生素耐药问题不容小觑,亟待发现新靶标新机制的细菌感染性疾病的治疗方法。细菌耐药的主要原因之一是生物背膜(BF)的形成,生物背膜使得细菌对抗生素的敏感度降低10-1000倍,而生物背膜的形成受到群体效应的调控,群体效应(QS)是一种调节细菌生物膜形成、毒力因子释放等生物行为的机制,因此群体感应抑制剂可以提高细菌对抗生素的敏感度,且使细菌处于无毒或低致病性状态。其优势在于不影响蛋白质的合成和细菌的生长,这样既减少了细菌的可遗传突变,也有利于联用其他抗生素。并且也不会因为破坏细胞,造成毒素释放,再度感染。群体效应根据信号分子的种类大致分为四种:革兰氏阳性菌中由寡肽类(AIP)介导的群体效应;革兰氏阴性菌中由高丝氨酸内酯类信号分子(AI-1)介导的群体效应;AI-2介导的群体效应;AI-3介导的群体效应。其中AI-2及AI-3介导的群体效应研究较少,由于AI-2广泛的存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中,共计约有70个菌种,且AI-3的结构机制目前尚不明确。因此本研究是集中于AI-2型群体效应抑制剂(QSI)的研究。近年来,虚拟筛选在先导化合物的发现中起到了非常重要的作用,通过模拟小分子与受体之间的相互作用,预测化合物靶向性。分子对接方法分为刚性对接、半柔性对接和柔性对接,这三种对接方法的精确度依次升高,同时也因为计算量依次增大,导致筛选速度依次降低。前期初筛在计算机中完成,大大提高了药物筛选的速度。GOLD是一个计算大分子与小分子结合模式的分子对接程序,是Sheffield大学,GlaxoSmithKline公司和CCDC协作的产物。它采用遗传算法(GA)进行蛋白-配体对接,对接时配体完全柔性和蛋白部分柔性,既做到受体活性位点氨基酸残基和配体是柔性的,又使得计算量较全柔性对接降低很多,所以在保证了计算精确度的情况下,筛选速度也有所提升,为本研究提供诸多便捷。2002年Chen X等人报道了LuxP晶体结构,其中包含原有的AI-2信号分子,提供了受体结构以及活性位点的位置,为基于结构的虚拟筛选寻找小分子抑制剂提供了支撑。因此本课题采用GOLD基于LuxP晶体结构开展AI-2型群体效应抑制剂的虚拟筛选与化合物的设计。首先采用GOLD中wizard模块虚拟筛选得到10个潜在抑制剂,再利用哈氏弧菌的生物发光实验测得化合物的IC_(50)。生物活性筛选的菌株是选用哈氏弧菌BB170菌株,由于野生型哈氏弧菌中同时含有AI-1、AI-2两种信号分子及其受体,而BB170菌株是哈氏弧菌的突变株,它缺少AI-1的受体LuxN,所以它不响应AI-1的信号变化,这样就不会干扰AI-2型群体效应的测定。活性测定以哈氏弧菌的生物发光强度为标准,当其生物发光强度降低一半时,计此时化合物的浓度为测试化合物的IC_(50)。根据活性数据和结构特点确定以Str5015为先导化合物,并利用PyMOL和LigPlot+分析设计得到目标化合物的母核,以及20个目标化合物的结构,合成得到20个目标化合物后,再次进行生物活性评价,得到活性与阳性对照相当的化合物YB-1,其IC_(50)达到7.1±2.89μM。综上所述,本研究首先利用计算机虚拟筛选进行化合物筛选,再经哈氏弧菌体外活性测试找到IC_(50)达到60μM的先导化合物3-溴苯基-3,5-二溴-2-羟基苯甲酸酯(Str5015),结合Str5015在活性位点与受体结合产生的相互作用,经合理设计分析后改造并合成了20个化合物,所有化合物均经过~1H-NMR和MS的确证。经活性测试发现了几乎所有目标化合物都有一定活性,且其中有活性达到7.1±2.89μM的结构新颖的化合物3,5-二溴-N-(2-溴-4-硝基苯基)-4-羟基苯甲酰胺(YB-1),此活性结果与阳性对照相当,并根据所有目标化合物活性结果总结构效关系:(1)两个苯环之间用酰胺键连接的活性优于用酯键连接;(2)R_4位置引入硝基可显著提高活性,且该位置取代基的吸电子能力越强,化合物活性越好;(3)当R_4位置为较强吸电子基团且R_3位置为较强给电子基团时,化合物活性较好;(4)当R_6为溴取代且R_5位置无取代时活性较好;(5)R_7位被碳酸酯链取代后活性将会得到提升。本研究对进一步改造YB-1寻找活性更好的小分子抑制剂有指导帮助的作用。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R914;R96

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