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《军事科学院》 2019年
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基于协同致死理论筛选大麻碱受体激动剂的联合抗肿瘤策略

贾新飞  
【摘要】:恶性肿瘤即将成为21世纪危害人类健康的头号杀手。随着现代生物学技术的进步、对肿瘤病理生理机制认识的深入,抗肿瘤药物研究有了快速的发展,肿瘤治疗水平有了显著的提升。目前,肿瘤已成为可治愈的疾病,带瘤生存成为肿瘤患者的一种新常态。因此,在最大化恶性肿瘤患者疗效的同时,提高肿瘤患者生存质量已成为肿瘤临床治疗越来越关切的问题。肿瘤的异质性、肿瘤治疗易发耐药、转移和复发等问题,使两药联合甚至是多药联合成为最大化恶性肿瘤疗效的必要措施。鉴于肿瘤患者在接受治疗的同时,还承受着疾病自身和药物治疗带来的疼痛、恶心、食欲不振、纳差、抑郁和焦虑等诸多毒副效应和不良反应,提供一种既可提高疗效又可改善患者生存质量的新药物联合策略具有重要的临床价值。然而,相关的联合方案尚属于空白。协同致死化学筛选,是协同致死筛选扩展至抗肿瘤药物联合筛选的无偏的临床前筛选手段。它不像临床联合用药的考察只局限于已上市药物,协同致死筛选可在全基因组范围内发现新的联合靶标,结合日益丰富的小分子靶向药库,能最大限度地发现可能的药物联合模式。在当前的肿瘤辅助治疗药物中,大麻碱受体(CBR)激动剂类药物是应对患者不良反应功效最全面的治疗药物,如:Cesamet治疗化疗引起的恶心和呕吐,Sativex用于治疗神经痛和癌疼;此外,大量研究证明,CB1R激动剂具有刺激食欲、改善不良情绪等作用;很多临床前也发现,CBR激动剂在多种肿瘤细胞系和小鼠移植瘤上具有抗肿瘤作用。基于CB1R激动剂在肿瘤治疗中的独特优势,本研究旨在发现联用CB1R激动剂的新的抗肿瘤联合组合。研究工作分两个部分:第一部分,基于激酶组基因RNAi筛选与WIN55212-2存在协同抗肿瘤作用的激酶抑制剂。首先,采用自主装细胞芯片的HCA和CCK-8细胞活力测定两种方法,通过RNA干扰(RNAi),在人类激酶组675个基因中筛选与CB1R激动剂WIN55212-2联合导致Hep G2细胞死亡或活力降低的激酶基因,以满足si RNA组相对细胞增殖比例1.09和si RNA组与联合组(si RNA+WIN)相对细胞增殖比例之差0.09的基因为可能阳性基因,共49个可能阳性基因,经文献和基因功能手册检索,选择了与肿瘤相关性较强的6个基因,包括TNK1、AXL、MKNK1、PRKCi、PDGFRL和MINK1;之后,在7株CB1高表达的肿瘤细胞系(Hep G2、HCT-8、DU145、SKOV3、MCF-7、PLC、MD-MB-231)上采用MTT法对初筛确定的6个基因进行联合致死复筛及扩筛,发现AXL基因si RNA与WIN55212-2联合在HCT-8和Hep G2细胞上具有协同致死活性,其中HCT-8上活性最强,由此确定AXL激酶是WIN55212-2联用的有效激酶靶标;第二,选择AXL激酶特异性抑制剂TP-0903在12株CB1R和/或AXLR高表达细胞(NCI-H446、NCI-H460、NCI-H462、HT-29、Hep G2、Bx PC3、PC3、SKOV3、PLC、MD-MB-231、Caco-2、HCT-8)上进行协同抗肿瘤筛选,发现TP-0903与WIN55212-2在Hep G2细胞上仅在TP-0903某一浓度下具有联合致死作用,在HT-29、Caco-2和HCT-8细胞具有联合致死作用,其中HCT-8细胞上联合活性最好,协同指数分别为:0.90、0.85、0.82、0.68、0.66;第三,采用HCT-8肿瘤细胞集落形成和3D肿瘤球增殖抑制试验验证TP-0903与WIN55212-2联合有效性,并在HCT-8小鼠移植模型上验证了TP-0903(0.13mg/kg)与CBR激动剂WIN55212-2联用显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长(P0.05 vs TP-0903 or WIN55212-2单用),抑制率大于两药单用抑制率之和,且毒性较低;第四,流式细胞术测定发现,与TP-0903单用相比,TP-0903与WIN55212-2联合显著增加HCT-8细胞凋亡率(P0.01)、导致HCT-8细胞发生G0/G1期阻滞;移植瘤组织Tunnel和CD31+的免疫组化分析证实,WIN55212-2联用TP-0903在体内也能增强TP-903诱导HCT-8移植瘤细胞凋亡的能力,协同TP-0903抑制移植瘤血管生成。第二部分,基于药-药联合筛选与CB1R激动剂具有协同抗肿瘤活性联用药物。首先,通过基于体外肿瘤细胞增殖和活力的高通量筛选(HTS):在7株CB1R高表达组织的肿瘤细胞系(Hep G2、DU145、HCT-8、MD-MB-231、MCF-7、SKOV3、SKOV3/T)上,从相应肿瘤适应症的25种抗肿瘤药物中,筛查与CBR1激动剂WIN55212-2具有协同抗肿瘤活性的组合,发现在Hep G2、DU145和HCT-8三株细胞上,8个药物(依西美坦、克里唑替尼、瑞格菲尼、雷洛昔芬、培美曲塞、氟维斯群、塞来昔布以及依维莫斯)与WIN55212-2具有较好的协同活性,其中依西美坦与WIN55212-2联合在Hep G2细胞上协同活性最佳,协同指数分别为:0.45、0.54、0.58、0.82、0.96;之后,依西美坦与WIN55212-2联合采用MTT方法在9株CB1R高表达肿瘤细胞(H4、BEL、Hep G2、PLC、MX-1、DU145、U251、PC3和HCT-8)上进行扩筛,确证依西美坦与WIN55212-2联合在Hep G2细胞系上协同效果最佳,协同指数为:0.42、0.48、0.59、0.72、0.75;在此基础上,通过Hep G2细胞集落形成实验和3D肿瘤球增殖抑制试验确证依西美坦与WIN55212-2联合作用,并在Hep G2皮下移植瘤模型的预实验中,观察到了初步的疗效,由于动物数量较少,未显示出统计学差异;初步的作用机制研究表明,在体内外,WIN55212-2与依西美坦联合均能促进依西美坦诱导的细胞凋亡(P0.01);WIN55212-2与低、高浓度依西美坦联用分别诱发细胞G2/M和S期阻滞。综合以上研究结果,本课题获得以下研究结论:1.AXL激酶抑制剂TP-0903与CB1R激动剂WIN55212-2在体外具有协同抗HCT-8细胞增殖作用;AXL激酶抑制剂TP-0903与CB1R激动剂WIN55212-2联合也具有协同抑制HCT-8小鼠移植瘤的作用;2.不可逆性甾体芳香酶灭活剂依西美坦与WIN55212-2在体外可协同增强抗Hep G2细胞的作用。在Hep G2小鼠移植瘤模型上也具有一定的作用,但作用不明显,有待将进一步的优化给药剂量;3.在体内外CB1R激动剂WIN55212-2与AXL激酶抑制剂TP-0903或芳香酶灭活剂依西美坦联合均增强了后者诱导细胞凋亡活性和细胞周期的阻滞作用。提示,两个组合的抗肿瘤作用均与细胞凋亡密切相关。4.在体内CB1R激动剂WIN55212-2可增强TP-0903抑制肿瘤组织血管生成的作用。总之,本课题基于协同致死化学筛选和药-药联合的体外筛选策略,首次发现了与CB1R激动剂具有协同抗结直肠癌和肝癌疗效的两个靶向药物组合,该联用组合为最大化肿瘤药物疗效并提高肿瘤患者生存质量的肿瘤治疗策略提供了新的思路。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R96

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