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线性泛素化底物鉴定及肿瘤相关机制研究

司甜  
【摘要】:蛋白质泛素化修饰普遍存在于真核生物,且在翻译后修饰类型中占据着重要作用。其是一种复杂的多酶参与的级联反应,泛素分子与底物分别在泛素激活酶(Ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,E2)和泛素连接酶(Ubiquitin ligase,E3)的参与下形成共价连接的不同偶联物,最后泛素分子被连接至底物蛋白的赖氨酸K残基上。其中在识别底物的过程中E3酶发挥了关键性作用。许多细胞过程受泛素化调控~([1-2]),例如真核细胞蛋白质选择性降解途径。此外,蛋白质泛素化修饰还参与并调控细胞周期、信号转导、转录调节、受体下调和内吞作用等多种生物学过程。一般可根据泛素分子间相连的赖氨酸K残基位置不同,分为K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位这七种泛素化修饰连接方式。近年来,一种以泛素分子首尾相连形成的新的泛素化修饰方式逐步走入人们的视野中,该泛素化的连接方式是一泛素分子C端的甲硫氨酸M共价连接另一泛素分子N端甘氨酸G,被形象地称为线性泛素化修饰~([3])。而线性泛素化修饰的生物学功能研究主要集中在NF-κB介导的免疫反应和细胞死亡等相关通路中。鉴于泛素化调控的关键性作用,其调控异常能够引发如癌症和神经退行性变等诸多疾病~([4]),成为严重威胁到人民健康和社会经济发展的公共卫生问题。NF-κB信号通路中IKK复合体的成员NEMO(NF-kappa-B essential modulator)是第一个被报道的能够发生线性泛素化修饰的蛋白底物,其结构上存在一个特异性亲和线性泛素链的UBAN(Ubiquitin binding in ABIN and NEMO proteins)结构域,此结构域能够通过招募线性泛素链而聚合NEMO分子~([5])。除此以外,目前人们对线性泛素化修饰底物和所调控的生物学功能知之甚少。因此探索更多未知的线性泛素化底物对于深入挖掘线性泛素化修饰所调控的生物学功能尤为重要。而受限于线性泛素链特殊的连接方式和线性泛素化修饰在细胞中极低的含量,线性泛素化修饰相关底物的鉴定较为困难。其中最关键的问题在于缺乏系统的筛选和鉴定线性泛素化底物的体系。本文拟采用在蛋白水平基于NEMO的UBAN结构域制作探针,利用该探针对线性泛素链结合的特异性并结合质谱技术来富集线性泛素化底物~([6])。利用上述实验方法,我们成功筛选到若干潜在的线性泛素化底物,而极光激酶A(Aurora kinase A,Aurora-A)即为新的线性泛素化潜在底物之一。极光激酶(Aurora kinase,AKs)蛋白家族是丝/苏氨酸激酶家族的重要组成部分,包括Aurora-A、极光激酶B(Aurora kinase B,Aurora-B)、极光激酶C(Aurora kinase C,Aurora-C)三个成员,该家族蛋白具有类似的催化结构域~([7]),且在功能上具有进化保守性,参与调控细胞周期检查点、纺锤体及中心体的成熟与组装、染色体分离和胞质分裂等在内的诸多生物学过程~([8-9])。AKs蛋白激酶家族的异常表达能够引发染色体功能紊乱从而促进肿瘤的形成与转移,且与多种肿瘤的预后不良密切相关。因此,针对AKs激酶开发相关抗癌药物已成为癌症相关的公共卫生领域的热点之一~([10])。Aurora-A是AKs蛋白激酶家族第一个被发现,也是最重要的成员,在细胞增殖过程中发挥着至关重要的作用。文献报道Aurora-A上的磷酸化修饰能够作为其激活的指标~([11]),且其自身活性在细胞周期中的G2期至M期转变时达到峰值,在其他时相中Aurora-A的激酶活性通过泛素-蛋白酶体途径来保持低水平~([12])。Aurora-A激酶活性的异常表达在多种恶性肿瘤中普遍存在,因此其激酶活性已成为肿瘤进展和预后的重要指标,是抗肿瘤药物的重要靶点之一。本项研究中我们通过线性泛素化相关实验证实了质谱鉴定结果,即Aurora-A具备与线性泛素链的结合能力,且干扰线性泛素化E3连接酶LUBAC(Linear ubiquitination assembly complex)后能够使Aurora-A磷酸化水平上调,而其磷酸化水平与激酶活性息息相关。该结果表明线性泛素化修饰可能通过下调Aurora-A的磷酸化水平来调控其作为细胞周期相关激酶的活性,参与调控细胞有丝分裂周期进程,进而影响肿瘤的发生发展等过程。综上所述,本文利用UBAN结构域和蛋白质组学构建的线性泛素化底物探针,能够有效捕捉和富集线性泛素化修饰的底物,在质谱水平鉴定到新的线性泛素化潜在底物Aurora-A,并设计实验证实Aurora-A能够与线性泛素链结合。进一步,通过小干扰RNA敲减LUBAC复合体不同组分,我们发现Aurora-A磷酸化水平均有所上调,发生激活。该现象表明线性泛素化修饰通过调控Aurora-A激酶活性从而影响细胞有丝分裂周期进程。本文构建的线性泛素化底物鉴定策略极大地丰富了该领域的研究方法,给线性泛素链的更多生物学功能探索和相关疾病研究提供了新的思路;也为基于Aurora-A激酶活性的抗肿瘤治疗研究提供新的策略,成为进一步攻克肿瘤治疗这一公共卫生难题的生物学基础。


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