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《军事科学院》 2019年
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鼠疫耶尔森氏菌aspA和fyuA特定突变与小鼠毒力关系研究

宋凯  
【摘要】:鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,简称鼠疫菌)是自然疫源性疾病鼠疫的病原体,在历史上曾引发三次鼠疫大流行。近年来虽然鼠疫疫情已在全球范围内得到较好的控制,但世界各地仍存在许多鼠疫疫源地。马达加斯加近几年鼠疫的爆发提示,对鼠疫菌的进化、致病性及致病机制等方面的研究仍是十分必要的。鼠疫历史疫情的考古微生物学研究表明,鼠疫菌约于5000-7500年前由假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,简称假结核菌)进化而来。鼠疫菌在由假结核菌进化而来的过程中,主要获得了pMT1(~100kb)和pPCP1(~10kb)两个质粒。此外,还从假结核菌继承了一个~70 kb的pCD1质粒(假结核菌中为pYV),pCD1为低钙响应质粒,主要编码三型分泌系统(type III secretion system,TTSS)及耶尔森外膜效应蛋白(yersinia outer proteins,Yops),对鼠疫菌在宿主体内的生存和扩散有重要作用。鼠疫菌一些代谢功能基因的失活是由单核苷酸多态性(SNP)位点变异导致的,如aspA(c.1087GT)的单个碱基突变可导致其编码产物丧失活性。鼠疫菌的致病性是鼠疫菌研究中重点关注的问题之一。田鼠型鼠疫菌对小鼠表现为强致死性(LD_(50)约为20 CFU),但与其他鼠疫菌不同的是,田鼠型菌株对大鼠、豚鼠等均不致死,这一毒力差异的遗传机制目前仍不明确。本课题就田鼠型鼠疫菌201株几个代谢功能相关基因特定位点变异与鼠疫菌对小鼠毒力的关系展开了探索。田鼠型鼠疫菌aspA基因第363位密码子为GTG,所编码的天门冬氨酸酶有完整活性,而自然界中绝大多数鼠疫菌aspA第363位密码子为TTG,天门冬氨酸酶完全失活。且该位点在所有鼠疫菌中至少存在九种基因型,是一个突变热点。本研究首先对实验室前期构建的aspA第363位密码子单碱基突变株201-aspA_(TTG)的表型变化进行了确认,并对该突变株进行了代谢组学检测分析。随后通过质粒回补和回复突变回补两种策略对其aspA基因进行回补,然而回补株均未恢复对小鼠的毒力。接下来通过基于自杀质粒pDS132的无痕突变技术,重新构建了鼠疫菌aspA第363位密码子的单碱基颠换突变株201-MT,由于重构建的aspA突变株与前期构建的201-aspA_(TTG)在对小鼠毒力方面不一致,为确认这一差异原因,对五株aspA突变相关菌株进行了基因组测序分析,发现在201-aspA_(TTG)中除存在aspA靶位点变异外,还发生了pCD1质粒约50 kb的大片段丢失,以及fyuA基因的一处GCA三个碱基的删除突变。为确认fyuA基因的删除突变对小鼠毒力的影响,通过基于自杀质粒pDS132的无痕突变技术,构建了fyuA基因靶标位点的GCA三个碱基的删除突变株201-fyuA_(GCAdel)。随后以pACYC184质粒为重组载体,完成了fyuA基因回补株201-fyuA-Comp的构建。通过对小鼠腹股沟皮下攻毒实验检测靶标位点的变异与鼠疫菌小鼠毒力的关系。小鼠的毒力检测以及基因组学分析结果显示,新构建的201-MT对小鼠毒力与野生型无明显差异,确定了鼠疫菌aspA基因的失活对其小鼠毒力无显著影响。而前期构建的aspA突变株对小鼠剧烈减毒的原因在于该菌株还存在pCD1质粒约50 kb的大片段丢失以及fyuA基因GCA三个碱基的删除两处变异。而201-fyuA_(GCAdel)对小鼠无致死性,说明fyuA基因靶标位点的GCA三个碱基的删除能够导致鼠疫菌对小鼠的剧烈减毒。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R378

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