收藏本站
《军事科学院》 2019年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

凋亡抑制蛋白拮抗剂对肿瘤细胞自噬的调节作用及机制研究

丁锐  
【摘要】:诱导肿瘤细胞凋亡以摧毁癌细胞是肿瘤化疗的主要策略之一。近年来,随着对细胞死亡机制研究的深入和细化,基于自噬、程序性坏死等死亡方式诱导肿瘤细胞死亡成为抗肿瘤药物研究的新方向。然而,细胞凋亡与自噬关系复杂,尽管它们共享多个重要的调控分子,但调节机制尚不清楚。因此,研究抗肿瘤药物诱发的细胞凋亡与自噬间的相互关系对于认识肿瘤细胞的调控机制、发现长期获益的肿瘤治疗药物具有重要价值。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一类重要的细胞凋亡抑制蛋白,与肿瘤发生发展密切相关,其拮抗剂作为抗肿瘤候选药物已进入临床研究的不同阶段。大量的基础与临床前研究表明,IAP拮抗剂选择性地结合到XIAP、cIAP1、cIAP2的BIR3结构域,激活细胞内源与外源性凋亡通路,诱导肿瘤细胞凋亡。近年来,一些IAP拮抗剂及其靶蛋白XIAP和cIAP1/2也被发现参与了肿瘤细胞自噬的调节,然而,有关调节机制的报道结论不一,缺乏系统的实验研究和信息。本课题组在2013年筛选新型IAP拮抗剂的实验中发现,IAP拮抗剂除诱导肿瘤细胞凋亡外,还对细胞自噬表现出不同程度的调节活性,且具有明显的肿瘤细胞特异性。鉴于IAP拮抗剂既特异地诱导细胞凋亡,又参与细胞自噬调节,本课题拟系统开展IAP拮抗剂的自噬调节机制研究,以进一步阐明IAP拮抗剂的抗肿瘤机制,揭示细胞凋亡与自噬的相互关系,为该类抗癌药物的开发提供理论依据。本论文的研究工作分为两部分。第一部分工作基于筛选发现本所合成的新型单体IAP拮抗剂WX20120108(GDC-0152类似物)具有更强的抗肿瘤活性和极强的细胞自噬调节活性,首先通过靶蛋白虚拟对接分析、靶蛋白结合和功能分析、靶蛋白相关NF-κB通路激活分析及细胞凋亡诱导等实验确证WX20120108具有典型IAP拮抗剂的生物学特性。在此基础上,以HeLa和MDA-MB-231细胞为实验对象,探查了WX20120108调节肿瘤细胞自噬的作用及其机制。免疫荧光高内涵分析、免疫印迹和透射电镜观察显示,WX20120108浓度(1-30μM)和时间(6-48 h)依赖地促进细胞自噬标志分子LC3B颗粒聚集,增加LC3B-II、p62蛋白表达,并在细胞中形成自噬体结构;自噬阻滞剂氯喹(chloroquine,CQ)显著增加WX20120108诱导的LC3B-II的含量,而WX20120108促进自噬体与溶酶体共定位,并促进溶酶体组织蛋白酶B(CTSB)与CTSD的活性。12株稳定表达EGFP-自噬起始相关信号蛋白的报告细胞系筛查和HeLa细胞验证实验发现WX20120108选择性地激活FOXOs蛋白家族,特别是Foxo3,具有浓度依赖关系,同时促进其下游靶基因Bnip3、Pik3c3、Atg4b和Atg5的上调,而这些基因表达产物是自噬起始的关键蛋白;进一步,Foxo3激活的调节机制的筛查显示,WX20120108促进细胞ROS释放,且WX20120108激活Foxo3、LC3B-II聚集作用可被自由基螯合剂过氧化氢酶catalase拮抗;而采用RNAi技术沉默靶蛋白XIAP、cIAP1和cIAP2不影响WX20120108诱导的ROS释放和Foxo3激活,仅在cIAP1/2沉默时降低WX20120108诱导的自噬水平。最后,本实验还发现,伴随WX20120108诱导细胞自噬程度增加,死亡细胞数量增加;泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK对WX20120108导致的细胞死亡具有保护作用,但不影响其自噬活性。综合以上实验结果可以看出,新型IAP拮抗剂WX20120108在其适应症的肿瘤细胞系HeLa和MDA-MB-231细胞上具有诱导细胞自噬的作用,该作用除部分依赖于靶蛋白cIAP1/2外,靶标非依赖的ROS-Foxo3通路激活是WX20120108诱发持续自噬的主要因素。此外,WX20120108先诱导自噬性细胞死亡,然后发生细胞凋亡,自噬如何促进凋亡发生,其机制有待进一研究。第二部分工作以已进入临床试验阶段的单体IAP拮抗剂GDC-0152和双体IAP拮抗剂TL32711为工具化合物,以HeLa和MDA-MB-231细胞为研究对象,探查了经典IAP拮抗剂对肿瘤细胞自噬的调节作用及其机制。与第一部分采用的实验方法基本一致。免疫荧光HCA、Western blot分析及透射电镜观察发现GDC-0152和TL32711都具有自噬调节活性;进一步,通过自噬流检测、自噬底物p62蛋白及mRNA水平检测、自噬体与溶酶体共定位分析、溶酶体酶活性检测发现GDC-0152和TL32711均能够促进自噬流,是细胞自噬的诱导剂,不同于单给药,在氯喹(CQ)存在时,双体拮抗剂TL32711诱导更多LC3B-II生成。敲减药靶发现,敲减XIAP和cIAP1/2均抑制TL32711的自噬活性,而GDC-0152的自噬调节活性仅在敲减cIAP1/2时被显著抑制。自噬调节活性的动态检测显示,两个拮抗剂均浓度和时间依赖地提高细胞LC3B蛋白水平,并伴有细胞数量的减少;流式细胞凋亡分析、HCA细胞坏死检测、细胞乳酸脱氢酶释放检测结合泛caspase抑制剂、程序性坏死抑制剂necrostatin-1及自噬抑制剂3-MA,确证两IAP拮抗剂诱导caspase依赖的肿瘤细胞凋亡及程序性坏死,而且化合物的自噬调节作用不受其凋亡诱导活性的影响。鉴于GDC-0152和TL32711促进自噬流却增加或不降低自噬底物p62水平,进行了p62 mRNA含量、p62与溶酶体、p62与RIP1蛋白的免疫荧光共定位和免疫共沉淀分析,结果两拮抗剂不同程度增加p62基因表达,TL32711处理细胞后p62部分与溶酶体共定位,GDC-0152处理细胞后p62与RIP1结合。综合上述结果可以看出:单体IAP拮抗剂GDC-0152和双体IAP拮抗剂TL32711在HeLa和MDA-MB-231细胞上均具有自噬诱导活性,该活性分别是cIAP1/2或cIAP1/2和XIAP依赖的;两拮抗剂通过自噬促进了肿瘤细胞凋亡的发生;二者还可以诱导一定程度的程序性坏死,其中GDC-0152通过介导p62与RIP1蛋白的相互作用,促进坏死小体的形成而诱导程序性坏死的发生。本课题首次系统探讨了不同类型IAP拮抗剂的自噬调节作用及机制,综合两部分的研究工作可得出以下研究结论:1)IAP拮抗剂在其适应症的肿瘤细胞系上具有诱导肿瘤细胞自噬的作用;2)IAP拮抗剂诱导肿瘤细胞自噬作用既存在靶标依赖性也存在靶标非依赖的机制,其中单体拮抗剂依赖于cIAP1/2,而双体依赖于XIAP和cIAP1/2;此外,GDC-0152及其类似物新IAP拮抗剂WX20120108还不同程度地激活ROS-Foxo3通路,诱导肿瘤细胞自噬。提示,IAP拮抗剂诱导自噬的作用决定于其自身的结构。3)IAP拮抗剂诱导的持续的细胞自噬促进了细胞凋亡,此外,程序性坏死也是IAP拮抗剂诱导细胞死亡的方式之一,并与p62密切相关。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R96

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄思茂;周越菡;;细胞自噬与癌症关系的研究进展[J];科技视界;2018年35期
2 刘爱玲;吕红;钱家鸣;;细胞自噬和衰老及衰老相关疾病[J];现代消化及介入诊疗;2019年04期
3 路帆;刘万林;;细胞自噬在激素性股骨头缺血性坏死的作用[J];世界最新医学信息文摘;2017年92期
4 赵书毅;;细胞自噬机制,不可或缺的细胞质量控制系统——2016年诺贝尔生理学或医学奖解读[J];中学生物学;2016年11期
5 吴劲松;;细胞自噬摭谈[J];生物学教学;2017年04期
6 苏杜林;王健;;对2016年诺贝尔生理学或医学奖的解读与讨论[J];中学生物教学;2017年07期
7 韩翠翠;;细胞自噬及相关试题分析[J];中学生物教学;2017年09期
8 奇云;;细胞自噬机制研究缘何摘得诺奖?——2016年诺贝尔生理学或医学奖解读[J];生命世界;2016年12期
9 王海杰;谭玉珍;;细胞自噬机制开启疾病治疗新途径[J];解剖学报;2017年01期
10 林承列;李江;周宜;孙艳红;王丽华;胡钧;樊春海;;基于细胞自噬机制的健康科学研究进展[J];核技术;2017年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 许赤;陈文捷;杨杨;李华;易述红;陈规划;;老年大鼠肝脏细胞自噬及其移植后改变[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年
2 刘杰民;纪云西;蒋历;黄贵华;郑超伟;郭超峰;;细胞自噬是探索中医药微观机制的新思路[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十四次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2012年
3 郭一;韩海啸;;细胞自噬在非酒精性脂肪性肝病作用机制的研究进展[A];第三十届全国中西医结合消化系统疾病学术会议论文集[C];2018年
4 杨键;邓玉杰;张晓燕;吕鹏飞;徐俊;杨颖;宁光;;脂肪细胞自噬检测方法的建立及意义探讨[A];中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议论文集[C];2012年
5 赵琳娜;林德贵;;细胞自噬的分子机制[A];第六届西部宠物医师大会论文集[C];2017年
6 陈宁;;运动干预对健康促进的分子生理机制:从细胞自噬角度的阐释[A];2018年中国生理学会运动生理学专业委员会会议暨“科技创新与运动生理学”学术研讨会论文集[C];2018年
7 代重山;汤树生;肖希龙;;细胞自噬调控分子机制最新研究进展[A];中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会会议论文集[C];2017年
8 夏福灿;郭振红;姜岩岩;邓常文;屈玉兰;邓捷文;蔡志坚;曹雪涛;王建莉;;B细胞自噬在过敏性哮喘发生发展中的作用及调节机制研究[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年
9 殷帆;陆利民;;细胞自噬在肾小管损伤机制中的研究进展[A];庆祝中国生理学会《生理学报》创刊90周年专辑[C];2017年
10 李康生;代剑平;;病毒感染与细胞自噬[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 孟婧;细胞自噬研究目前仍处于初级阶段[N];江苏科技报;2019年
2 记者 张梦然;细胞自噬关键蛋白突变可延寿[N];科技日报;2018年
3 记者 刘海英;美找到刺激细胞自噬新策略[N];科技日报;2018年
4 记者 严粒粒;细胞自噬与多种疾病密切相关[N];浙江日报;2016年
5 记者白毅;介入细胞自噬过程可减轻缺血性脑损伤[N];中国医药报;2009年
6 记者 张建琛 通讯员 李静;我科学家发现细胞自噬密码[N];科技日报;2012年
7 ;细胞自噬的奥秘被发现[N];农村医药报(汉);2007年
8 小亦;日发现细胞自噬奥秘[N];中国医药报;2007年
9 常丽君;英发现控制细胞自噬过程分子开关[N];科技日报;2012年
10 记者 钱铮;细胞自噬作用有“油门”“刹车”[N];新华每日电讯;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 丁锐;凋亡抑制蛋白拮抗剂对肿瘤细胞自噬的调节作用及机制研究[D];军事科学院;2019年
2 康成容;PI3K/Akt/mTOR介导的细胞自噬在钽颗粒促成骨细胞增殖中的作用研究[D];南方医科大学;2018年
3 马梅生;人源PI3KC3复合物结构及其膜结合特征的研究[D];清华大学;2017年
4 苗超峰;Foxd3在肝细胞癌发生发展中的作用研究[D];郑州大学;2017年
5 王荔娜;HBO1乙酰化酶复合体参与调控线粒体功能以及细胞自噬的分子机制的研究[D];华东师范大学;2016年
6 朱赟;MSCs调控STAT3影响肝内胆管上皮细胞自噬通量治疗原发性胆汁性肝硬化的机制研究[D];南京医科大学;2016年
7 段秀英;细胞自噬调控细胞质内蛋白稳态和脂质代谢[D];浙江大学;2019年
8 张梅;miR-337及细胞自噬相关基因LC3B、p62、p53在人视网膜母细胞瘤中的功能和意义[D];安徽医科大学;2016年
9 王志勇;扶正祛邪方对APP/PS1 HEK293细胞自噬功能调节作用的研究[D];北京中医药大学;2017年
10 冯艳玲;细胞自噬相关蛋白Atg7抑制PKM2磷酸化参与Warburg效应调节影响细胞上皮间质转化[D];中国医科大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李枫;国内外细胞自噬领域研究的主题分析[D];山西医科大学;2019年
2 朱桓毅;Sb、As、Cd胁迫下蜈蚣草体内重金属形态、酶活性与细胞自噬的关系[D];贵州大学;2019年
3 邓才幸;5种氧化异阿朴菲生物碱Pt(Ⅱ)配合物的抗肿瘤机制研究[D];广西师范大学;2019年
4 刘静;黑根霉胞外多糖促进U87MG细胞自噬及其分子机制研究[D];山东大学;2019年
5 阚科佳;接头蛋白GAB1调控血管平滑肌细胞自噬参与动脉粥样硬化的实验研究[D];上海交通大学;2017年
6 段瑞雪;Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响[D];山西医科大学;2019年
7 曹丽;肠道病毒71型诱导的细胞自噬通过NLRP3炎性小体调控细胞凋亡和焦亡[D];山西医科大学;2019年
8 侯晓楠;DUB-X在细胞自噬中的生物学功能研究[D];厦门大学;2017年
9 朱叶;西兰花异硫氰酸酯提取及诱导小鼠黑色素瘤B16细胞自噬的分子机制研究[D];浙江科技学院;2019年
10 韩乐;环境雌激素双酚A诱导山羊睾丸支持细胞自噬发生的研究[D];南京农业大学;2017年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026