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《军事科学院》 2019年
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芬太尼致呼吸抑制的可能机制研究

梁晓南  
【摘要】:目前为止,阿片类药物(opioid drug)依然是临床上治疗中度至重度疼痛的首选药物。芬太尼类化合物是阿片类药物的代表,具有良好的镇痛活性,剂型多样、起效迅速,已成为全球使用最广泛的术中镇痛药物,同时还可作为麻醉辅助用药与麻醉药合用。但该类化合物由于中枢神经系统的不良反应,如成瘾、耐受,尤其是呼吸抑制等副作用,极大的限制了临床上的应用,成为患者停药的主要原因。尽管临床方面采用阿片受体拮抗药(如纳洛酮)可逆转呼吸抑制,但该类药物会显著减弱芬太尼类化合物的镇痛效果。因此,通过研究芬太尼类药物呼吸抑制效应的生物学机制,指导开发镇痛效果确切且呼吸抑制副作用低的新型镇痛药物成为目前研究的重要思路。芬太尼类化合物在体内通过激动阿片受体(opioid receptor)而发挥生物学效应。一方面,阿片受体激动剂(如芬太尼)通过改变受体构象激活受体,使与受体偶联的G蛋白活化,产生下游信号。另一方面,阿片受体也可以通过非G蛋白信号通路,如β-arrestin途径产生信号:β-arrestin是G蛋白信号的负反馈调节蛋白,参与受体脱敏、内化及再循环,终止G蛋白信号转导。最新研究发现,Epac(exchange protein directly activated by cAMP)也是cAMP下游靶分子,可与PKA(protein kinase A)相互影响或单独介导生物学效应。已有研究证实,β-arrestin 2敲除小鼠(βarr2-KO)表现为吗啡镇痛作用增强,对慢性吗啡处理不产生明显耐受且呼吸抑制作用明显减轻,提示β-arrestin 2可能调节了吗啡呼吸抑制效应,但芬太尼呼吸抑制效应是否与β-arrestin 2相关并不清楚;另有研究表明,PDE4(phosphodiesterase 4)抑制剂通过增加神经元胞内cAMP含量也可逆转吗啡产生的呼吸抑制效应,但cAMP在芬太尼致呼吸抑制中的分子机制仍无定论。吗啡与芬太尼在受体后信号转导上有明显区别,可能二者呼吸抑制产生的生物学机制也并不相同。本研究为解释芬太尼呼吸抑制机制,从与阿片受体信号传导通路以及可能影响该通路的相关受体开始研究。首先我们对β-arrestin 2是否参与芬太尼类化合物呼吸抑制效应进行确证,拟选用原代神经元细胞、正常及转基因动物观察芬太尼致呼吸抑制效应与β-arrestin 2相关性;并进一步分析G蛋白下游信号通路在其中的作用,包括cAMP水平及cAMP下游PKA、Epac水平,并结合其他受体,如:肾上腺素受体、NMDA受体,尝试阐明芬太尼呼吸抑制效应与阿片下游信号通路中哪些分子相关。具体研究如下:研究目的:本课题的研究目的是考察芬太尼呼吸抑制效应与β-arrestin 2或经典G蛋白信号通路相关,进一步探讨与芬太尼类化合物呼吸抑制效应相关的信号分子,并在分子水平上探讨芬太尼类化合物呼吸抑制效应的可能机制。研究方法:1.β-arrestin 2信号通路与芬太尼类化合物致呼吸抑制相关性采用原代神经元培养的方法研究芬太尼衍生物对β-arrestin 2表达情况的影响;检测急性给药30和120 min时,芬太尼衍生物对大鼠皮层、海马和延髓中β-arrestin 2表达情况的影响;在正常动物模型中给予β-arrestin 2通路抑制剂研究该蛋白与芬太尼致呼吸抑制效应的相关性;最后,在βarr2-KO动物上进一步确证。2.G蛋白信号通路在芬太尼致呼吸抑制中的作用采用脑室给予GIRK(G protein gated inwardly rectifying K channels)抑制剂的方法,在整体动物水平考察G_(βγ)下游信号对芬太尼致呼吸抑制影响;采用脑室给予cAMP类似物8-Br-cAMP或静脉给予PDE4抑制剂Rolipram的方法,考察cAMP对芬太尼致呼吸抑制的影响;脑室给予PKA抑制剂H89、KT5720、Rp-cAMPs考察PKA对芬太尼致呼吸抑制影响;在整体动物水平上,考察肾上腺素受体及NMDA受体与芬太尼呼吸抑制效应相关性。3.Epac(exchange protein directly activated by cAMP)对芬太尼呼吸抑制效应的影响采用脑室给予Epac激动剂8-pCPT的方法,在整体动物水平上考察该分子在芬太尼致呼吸抑制效应中的作用;采用脑室给予MEK抑制剂U0126、SL327的方法,考察整体动物水平上ERK磷酸化对芬太尼致呼吸抑制的影响;在CHO-μ细胞系上检测8-pCPT对芬太尼及吗啡致ERK磷酸化的影响;PC12细胞系上考察芬太尼及吗啡处理后,胞内磷酸化ERK的分布情况。研究结果:1.β-arrestin 2不参与芬太尼致呼吸抑制效应吗啡(1μM)与芬太尼衍生物Fentanyl-001(1,10μM)急性处理1 h不影响皮层原代神经元细胞中β-arrestin 2的表达量;芬太尼衍生物Fentanyl-001(20μg/kg,i.v.)急性处理30 min后,大鼠延髓、海马中的β-arrestin 2表达量不变(P0.05),皮层中的β-arrestin 2表达下降(P0.05);芬太尼衍生物(20μg/kg,i.v.)急性处理120 min后,大鼠延髓、海马及皮层中β-arrestin 2表达量不变(P0.05);脑室给予大鼠(25μg/site,i.c.v.)、小鼠(50μg/site,i.c.v.)GRK2抑制剂,不影响芬太尼致呼吸抑制效应(P0.05);给予βarr2-KO小鼠吗啡(50 mg/kg,s.c.)和芬太尼(0.4 mg/kg,s.c.)后实验结果显示,同WT小鼠相比,吗啡给药后40-90 minβarr2-KO小鼠由吗啡所致吸气时间(F_(2,162)=9.53,P0.01)与呼气时间(F_(2,162)=7.59 P0.01)增加幅度明显降低。而同WT动物相比,芬太尼给药10 min后βarr2-KO动物呼吸频率、吸气时间、呼气时间和分钟通气量均无统计学差异(P0.05)。2.G蛋白信号通路在芬太尼致呼吸抑制中的作用GIRK抑制剂Tertiapin-Q(0.5,2.0μg/site,i.c.v.)剂量依赖性地缓解由芬太尼所致呼吸频率降低(F_(2,114)=5.87,P0.05),吸气时间增加(F_(2,108)=4.97,P0.05)。Tertiapin-Q(0.5,2.0μg/site,i.c.v.)有缓解呼气时间增加的趋势但无统计学差异(P0.05),Tertiapin-Q有缓解由芬太尼所致分钟通气量降低的趋势但各组无统计学差异(P0.05)。cAMP类似物8-Br-cAMP(100μg/site,i.c.v.)不影响芬太尼所致呼吸频率降低、吸气时间、呼气时间延长(P0.05)。PDE4抑制剂Rolipram(1,2 mg/kg,i.v.)不影响芬太尼所致呼吸频率降低、吸气及呼气时间延长(P0.05)。PKA抑制剂H89(50μg/site,i.c.v)可明显缓解由芬太尼所致呼吸频率降低(F_(2,108)=17.94,P0.001),减少由芬太尼所致的吸气时间(F_(2,108)=6.48,P0.01)和呼气时间(F_(2,108)=12.30,P0.001)延长,但是不影响由芬太尼所致分钟通气量降低(P0.05)。PKA的抑制剂KT5720(10μg/site,i.c.v)明显缓解由芬太尼所致呼吸频率降低(F_(1,48)=26.93,P0.001),缓解吸气时间延长(F_(1,48)=9.60,P0.05),缓解呼气时间延长(F_(1,48)=20.67,P0.01)。PKA的抑制剂Rp-cAMPs可以缓解由芬太尼引起的呼吸频率降低。肾上腺素受体可能参与了芬太尼所致呼吸抑制,NMDA受体辅助激动剂D型-丝氨酸不参与芬太尼致呼吸抑制效应。3.Epac参与芬太尼致呼吸抑制及其相关机制Epac激动剂8-pCPT(10,20μg/site,i.c.v)可以明显缓解由芬太尼所致呼吸频率降低(F_(2,120)=4.70,P0.05),减少给药后吸气时间(F_(2,120)=6.39,P0.01),呼气时间(F_(2,120)=8.55,P0.01),增加动物分钟通气量(F_(2,120)=4.16,P0.05)。MEK抑制剂U0126、SL327可以显著增加芬太尼处理后动物的呼吸频率(F_(2,96)=16.41,P0.001),降低动物的吸气时间(F_(2,96)=7.86,P0.01)和呼气时间(F_(2,96)=21.70,P0.001)。JNK抑制剂SP600125和MEK抑制剂U0126不影响吗啡致小鼠呼吸抑制(P0.05)。8-pCPT预处理可以降低由芬太尼所致CHO-μ细胞系ERK磷酸化水平增加,增加吗啡致ERK磷酸化水平。吗啡与芬太尼致PC12细胞磷酸化ERK胞内分布不同,芬太尼处理后胞内磷酸化ERK主要分布在细胞核,吗啡处理后磷酸化ERK主要分布在细胞质。研究结论:芬太尼与吗啡致呼吸抑制机制不同,β-arrestin 2不参与芬太尼呼吸抑制效应,其原因可能与芬太尼处理后ERK磷酸化持续时间及胞内分布与吗啡不同有关;整体动物水平改变cAMP含量不影响芬太尼呼吸抑制效应,Epac与PKA均参与芬太尼致呼吸抑制效应;Epac激动剂缓解芬太尼呼吸抑制效应的机制可能与抑制胞内ERK磷酸化有关。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R96

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