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《军事科学院》 2019年
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规模化养殖场猪流感病毒监测及人群感染的前瞻性队列研究

王国林  
【摘要】:一、研究背景针对流感大流行,以往各国将主要精力放在了应对禽流感病毒特别是H5N1高致病性禽流感病毒的威胁。然而,2009年新型H1N1流感病毒在墨西哥、美国等地突然出现,并迅速在全球蔓延,引起流感大流行。基因序列分析表明,造成2009年世界大流行的新甲型H1N1流感病毒含有猪、禽及人流感病毒的基因片段,进化分析显示其与猪流感病毒(Swine influenza viruses,SIVs)密切相关,并最初将该型流感命名为“猪流感”,引起人们的普遍关注。新型猪源H1N1流感病毒的突然出现,使人们为之震惊,不得不重新审视以往的认识和做法。SIVs属于正粘病毒科甲型流感病毒属,基因组由8个单股负链RNA片段组成。这种片段化的基因组特征,使得病毒很容易发生重组,并经常导致新病毒的出现。猪呼吸道上皮细胞包含α-2,3和α-2,6唾液酸受体,既可以感染SIVs,也可以感染禽源和人源的流感病毒。因此,猪被认为是甲型流感病毒的“混合器”,在“禽-猪-人”的种间传播链中,扮演着流感病毒中间宿主及多重宿主的作用。目前,SIVs流行的亚型主要有H1、H3、N1和N2,呈世界范围性分布,但以地方性流行为主,主要分布在欧洲、北美和东亚地区。我国生猪养殖业近年来发展迅速,目前已是世界上最大的猪肉生产国,而且近些年,我国大部分的小型家养猪场已被规模化养殖场(Confined animal feeding operations,CAFOs)所取代。CAFOs中SIVs亚型分布多样,加之我国人口密度高,家畜、家禽饲养数量多,候鸟丰富且迁徙路线广,这都为SIVs与人源、禽源流感病毒的重组和传播提供了良好的条件,使得多种病毒重组产生新型流感病毒的几率增加,人群被感染的机会增多。目前,由于对猪流感缺乏系统和纵向的监测,在很大程度上阻碍了对流感病毒进化的认识,而且现有的大多数数据来源于不同地区病猪的样品,而非来自于特定地区的前瞻性研究,对SIVs的进化、种间传播和人群感染危险度的认识比较局限。因此,本研究通过开展CAFOs监测、职业暴露人群的前瞻性队列研究和人群流感样病例(Influenza-like illness,ILI)监测,明确CAFOs中SIVs流行和分布情况,掌握人群SIVs感染率及感染危险因素,寻找SIVs种间传播证据,对SIVs防控工作的开展提供参考建议。二、研究目的通过在CAFOs中开展SIVs的监测,明确CAFOs中SIVs的流行和分布情况。开展猪暴露人群及当地一般人群的队列研究,确定职业暴露人群SIVs的感染率、感染的生物学标志物及其感染的危险因素。通过队列人群周随访,及时发现ILI,分离病原体,寻找SIVs跨种传播的直接证据。通过基因序列测定和系统发育分析,掌握队列人群及猪群流感病毒分离株的特征,明确人、猪及其环境中流感病毒的传播规律。三、研究方法2015年3月至2018年9月期间,在山东和江苏省先后纳入11家CAFOs进行主动监测,每个月采集猪口腔分泌物和猪场环境标本(粪便、环境水、环境拭子、生物气溶胶),填写采样登记表(时间、位置、猪龄等)和养殖场月随访表(生猪数目、猪群健康状况、天气状况等)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)对所有样本进行甲型流感病毒的检测,Ct值≤38判定为甲型流感病毒阳性,阳性标本采用MDCK细胞进行分离培养。流感病毒分离株和未分离成功但Ct值≤30的标本,进行病毒序列测定,然后进行氨基酸突变位点分析和系统发育分析,明确SIVs的生物学特性和遗传进化特征。2015年3月至2017年12月期间,在CAFOs、屠宰厂和猪肉交易市场招募猪暴露人群,并纳入一般人群作为对照,进行两年的前瞻性随访研究。人群纳入时收集人口学、职业暴露史及疾病史等信息,采集血清和鼻洗液标本。每年随访一次,填写年随访表,采集研究对象血清和鼻洗液标本。采用q RT-PCR检测鼻洗液甲型流感病毒,采用犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞对阳性标本进行分离培养。采用微量中和(Microneutralization,MN)实验检测血清中猪H1N1、H3N2及禽H5N1、H5N6、H7N9和H9N2亚型流感病毒的抗体滴度。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测鼻洗液总免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,Ig A)及猪H1N1、H3N2特异性Ig A抗体浓度。通过电话或家访的形式对纳入的研究对象进行周随访,一旦发现ILI,进行ILI调查,填写ILI调查表,采集鼻洗液、鼻咽拭子和急性期血清标本,30天后再次随访并采集恢复期血清标本。采用q RT-PCR检测鼻洗液和鼻咽拭子甲型流感病毒,采用MDCK细胞对阳性标本进行分离培养,分离株进行全基因组测序,然后进行系统发育分析。采用MN实验检测血清抗体滴度,分析急性期/恢复期血清MN抗体滴度的变化特征。采用ELISA实验检测鼻洗液Ig A抗体浓度,比较发病前后鼻洗液Ig A抗体浓度的变化。定性资料采用χ2检验或Fisher精确检验,定量资料采用t检验或方差分析。对于CAFOs监测资料,采用单因素分析计算比值比(Odds ratio,OR)和95%置信区间(Comfidence interval,CI),明确影响各类型标本甲型流感病毒检测阳性的危险因素。对于人群资料,使用单因素和多因素Logistic回归分析计算OR值和95%CI,明确人群感染不同亚型流感病毒的危险因素。使用泊松回归模型计算发病密度比值比(Incidence rate ratio,IRR)和95%CI,确定暴露人群针对不同亚型猪流感病毒的发病密度同一般人群的区别。所有的统计学检验均为双侧检验,P0.05认为存在统计学差异。用Epi Data 3.1软件(Odense,Denmark)和SPSS Statisitic 21.0软件(SPSS,Chicago,Illinois,USA)进行数据录入和分析。采用Graph Pad Prism5.0软件和Adobe Illustrator CS6软件绘制统计图表。四、研究结果2015年3月至2018年9月在CAFOs开展SIVs监测期间,共采集标本17525份,其中猪口腔分泌物标本11864份,粪便标本1427份,环境水标本1427份,环境拭子标本1427份及生物气溶胶标本1380份。甲型流感病毒阳性率为7.7%(1344/17525),口腔分泌物、粪便、环境水、环境拭子和生物气溶胶标本甲型流感病毒阳性率分别为8.4%(1002/11864)、4.9%(70/1427)、5.9%(84/1427)、8.1%(115/1427)和5.3%(73/1380),口腔分泌物标本甲型流感病毒阳性率最高,粪便标本阳性率最低。甲型流感病毒呈夏季6/7月和冬季1/2月季节性双峰流行的特点,仔猪等周龄较小的猪群更容易感染SIVs。通过对34株分离株和113份Ct值≤30的样本进行序列测定和比对分析,结果显示CAFOs流行着多种亚型SIVs,包括欧亚H1N1、pdm09 H1N1、猪H1N2和猪H3N2多种亚型,其中欧亚H1N1亚型是最主要的流行株。欧亚H1N1、pdm09 H1N1和猪H3N2亚型流感病毒之间均存在基因片段的频繁重配。氨基酸关键位点分析发现,所有H1N1和H1N2亚型流感病毒在HA蛋白受体结合区存在E190D、G225E/D和R226Q位点突变,所有H3N2亚型流感病毒在HA蛋白上受体结合区存在Q226I和G228S位点突变,这些突变均与对人类受体的结合能力增强有关。14株H1N1亚型流感病毒在NA蛋白上存在N248D的耐药性突变。H1N2和所有H3N2亚型流感病毒在NA蛋白上存在I122V的耐药性突变。1株H1N1流感病毒在PB2蛋白上存在D701N位点突变,与病毒致病力和传播力的增强有关,而其余所有病毒在PB2蛋白上均存在T271A和Q591R的突变。所有病毒均未发现PB1-T296R和PB2-E627K位点突变。2015年3月至2017年12月期间,开展了人群感染SIVs的前瞻性队列研究。针对猪H1N1病毒,基线调查结果显示猪暴露人群血清MN抗体阳性率高于对照人群(13.1%和6.0%,P=0.046);基于不同年份间双份血清MN抗体,暴露人群阳转率为19.9%,对照人群为12.1%,组间存在显著性差异(P=0.019);猪暴露人群血清MN抗体阳转密度(13.93/100人年)显著高于对照人群(8.64/100人年),组间存在显著性差异(IRR=1.713,95%CI 1.002-2.926,P=0.047)。进一步因素分析发现,猪群暴露(调整OR=2.108,95%CI 1.265-3.511)和工作时猪群发生疫情(调整OR=3.349,95%CI 1.170-9.592)是猪暴露人群感染猪H1N1病毒的危险因素。针对猪H3N2病毒,基线调查时,猪暴露人群比对照人群血清MN抗体阳性率更低(36.8%和52.0%,P=0.007);不同年份间双份血清MN抗体阳转率为暴露人群12.2%和对照人群20.7%,组间存在显著性差异(P=0.003);猪暴露人群血清MN抗体阳转密度(8.81/100人年)显著低于对照人群(14.09/100人年),组间存在显著性差异(IRR=0.589,95%CI 0.360-0.964,P=0.034)。经常穿戴防护鞋是感染猪H3N2病毒的保护因素(调整OR=0.391,95%CI 0.156-0.980)。另外,禽H5N1、H5N6、H7N9和H9N2亚型流感病毒血清MN抗体检测发现,1名暴露人群在两次年随访中H5N6病毒血清MN抗体均呈阳性,且发生了阳转。3名暴露人群和1名对照人群在不同时间点H9N2病毒血清MN抗体呈阳性,其中2名暴露人群和1名对照人群发生了血清MN抗体阳转。所有研究对象H5N1和H7N9亚型禽流感病毒的血清MN抗体均为阴性。同时,本研究对队列人群鼻洗液标本中总Ig A和猪特异性Ig A抗体浓度进行了分析。基线调查结果显示猪暴露组总Ig A抗体浓度(1754ng/m L和585ng/m L)、猪H1N1特异性Ig A抗体浓度(653ng/m L和97ng/m L)和猪H3N2特异性Ig A抗体浓度(1074ng/m L和434ng/m L)均高于对照组(P0.001)。后续两次年随访总Ig A抗体、猪特异性Ig A抗体浓度,猪暴露组也均高于对照组。进一步因素分析发现,针对猪H1N1特异性Ig A抗体,猪群暴露(调整OR=2.607,95%CI 1.674-4.059)及吸烟史(调整OR=1.385,95%CI 1.066-1.800)是其浓度升高的危险因素。针对猪H3N2特异性Ig A抗体,猪群暴露(调整OR=2.167,95%CI 1.434-3.274)、吸烟史(调整OR=1.428,95%CI 1.092-1.868)及30天内服药史(调整OR=1.685,95%CI 1.250-2.270)是其浓度升高的危险因素。本研究还开展队列人群ILI监测,研究期间累计报告56人次,其中暴露人群41人次,对照人群15人次。32人次(57.1%)ILI成组血清(基线纳入或随访时/急性期/恢复期)猪H1N1或H3N2流感病毒MN抗体滴度发生了四倍或四倍以上升高,其中22人次(39.3%)和17人次(30.4%)ILI成组血清分别对猪H1N1和H3N2流感病毒MN抗体滴度有四倍或四倍以上升高。ILI鼻洗液总Ig A、猪H1N1特异性Ig A和猪H3N2特异性Ig A抗体浓度均较纳入或随访时鼻洗液样本Ig A抗体浓度降低(P0.05)。对2株ILI鼻洗液分离株进行系统发育分析,发现其与同期猪群中SIVs序列HA(99.17-100%/98.40-100%)、NA(98.93-100%/98.28-100%)和M(99.59-100%/99.38-100%)基因片段的核苷酸及氨基酸序列高度同源,且关键氨基酸突变位点具有一致性,提示流感病毒在猪群和人群间发生了跨种传播。五、研究结论(1)SIVs在CAFOs中广泛流行,包括欧亚H1N1、pdm09 H1N1、猪H1N2和猪H3N2多种亚型流感病毒,其中欧亚H1N1亚型流感病毒是主要的流行株;SIVs不同亚型间,同一亚型内部基因片段重配现象普遍。(2)暴露人群猪H1N1病毒的血清MN抗体阳性率、阳转率和阳转密度均高于对照人群,提示其感染猪H1N1流感病毒的风险更高。(3)猪暴露人群鼻洗液总Ig A、猪H1N1特异性Ig A和猪H3N2特异性Ig A抗体浓度均高于对照人群,提示其可能是SIVs感染的生物学标志物。(4)ILI成组血清MN抗体滴度四倍或四倍以上升高及ILI病毒分离株与猪群中流感病毒序列高度的同源性,提示SIVs在人群和猪群间发生了跨种传播。六、意义和创新性本研究运用One Health理论,将CAFOs中猪群、猪场环境及人群作为一个整体进行前瞻性队列研究。通过系统、长期的监测,发现SIVs在CAFOs中广泛流行,基因型多样且重配现象普遍。在CAFOs中检测到生物气溶胶甲型流感病毒阳性标本,有助于理解SIVs的传播机制。血清学调查提示猪暴露人感染猪H1N1流感病毒的风险更高,是猪流感防控的重点人员。首次在队列人群中开展鼻洗液Ig A抗体研究,结果显示Ig A抗体可能是SIVs感染的生物学标志物。CAFOs猪群中同期流感病毒与人群ILI病毒分离株序列高度同源,提供了流感病毒跨种传播的病原学证据。
【学位授予单位】:军事科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R511.7;S858.28

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