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《中国人民解放军军事医学科学院》 2011年
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长双歧杆菌NCC2705果糖ABC转运系统的研究

刘大伟  
【摘要】:双歧杆菌(Bifidobacterium,B. longum)是人体肠道内最重要的益生菌,具有改善营养、增强免疫、抗过敏、抗肿瘤、抗感染、抗衰老、调整肠道菌群平衡等诸多重要的生理功能。随着双歧杆菌制品在世界范围内的广泛应用及微生物学等学科的发展,双歧杆菌受到了越来越多的重视,并已成为肿瘤靶向治疗和基因疫苗载体的理想研究对象。双歧杆菌具有广泛的代谢途径,以便在肠道逆境中迅速利用稀少的宿主不能降解的碳水化合物并形成生长优势,进而定植和生存。几种非消化性的碳水化合物如寡聚果糖、菊粉和棉子糖已经被证明为益生因子并作为食品添加剂选择性促进双歧杆菌在肠道中的生长。人的肠道中存在很多种类的单糖、双糖和低聚糖,尽管双歧杆菌能利用这些单糖作为唯一的碳源,但目前对将这些糖吸收并转运到胞内的特异性和代谢途径的分子机制尚不清楚。本研究通过对长双歧杆菌NCC2705糖发酵的蛋白质组学研究,阐述了长双歧杆菌NCC2705中一个新型糖ABC转运系统的组成成分、蛋白功能、相互作用,并对该系统进行了分子机制的相关研究。 首先,我们明确了B. longum NCC2705能够利用六种单糖作为唯一碳源生长,包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖和甘露糖。生长曲线表明,B. longum NCC2705在果糖、核糖、木糖和半乳糖中比在葡萄糖和甘露糖中有更高的生长率。在B. longum NCC2705的生长过程中,其发酵产生的乙酸和乳酸的摩尔比从1.27到2.61,乳酸产生量由低到高依次为甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖、果糖。这表明双歧杆菌可以偏好性优先利用果糖、核糖、木糖作为碳源。 为了确定B. longum NCC2705单糖的代谢通路,我们对以果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、核糖和葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长的B. longum NCC2705进行了比较蛋白质组学研究。与在葡糖糖培养基中生长的NCC2705相比,在果糖、半乳糖、木糖、核糖和甘露糖中生长的NCC2705总共鉴定到136个差异蛋白点,通过MALDI-TOF/TOF MS/MS和ESI-MS/MS质谱技术鉴定共68个蛋白表现出了3倍以上的差异表达。同时,提取了B. longum NCC2705的总RNA分析这些基因在转录水平上进行半定量RT-PCR分析,半定量RT-PCR的结果同蛋白质组学的结果一致。这些差异蛋白主要包括:(1)ABC转运系统成分;(2)代谢酶类;(3)关键的应激酶;(4)翻译相关蛋白;(5)转录调节蛋白;(6)假想蛋白。这些差异蛋白大多为胞质蛋白,其中4个蛋白序列预测含有信号肽。这些结果表明,碳源的改变可以对B. longum NCC2705产生广泛的影响。 此外,有多个蛋白在2-D凝胶上出现了位移的现象,我们推测可能是这些蛋白发生了断裂或翻译后修饰。因此对这些蛋白进行Pro-Q磷酸化染色并结合一抗分别是抗磷酸基-丝氨酸(Anti-phosphor-serine,Anti-P-Ser)、抗磷酸基-苏氨酸(Anti-phosphor-threonine,Anti-P-Thr)、抗磷酸基-酪氨酸(Anti-phosphor- tyrosine ,Anti-P-Tyr)的Western Blot技术,结果显示包括伴侣蛋白(GroEL, BL0002)、烯醇酶(Eno, BL1022)、转醛醇酶(Tal, BL0715)和葡萄糖磷酸变位酶(Pgm, BL1630)存在着不同的磷酸化。这四个蛋白均含有磷酸化的丝氨酸残基,并且伴侣蛋白(GroEL, BL0002)和烯醇酶(Eno, BL1022)都是在酪氨酸残基位点发生磷酸化。 本研究中值得关注的是,BL0033(可能的ABC转运系统的糖结合蛋白),在果糖、核糖和木糖培养基中出现了高丰度的表达。相对于在葡萄糖培养基中的表达,BL0033的表达丰度在上述三个培养基中出现了高达50倍的上调。通过MALDI-TOF/TOF MS/MS和ESI-MS/MS质谱结果,我们鉴定出BL0033在果糖培养基中生长时有5个同分异构体,Pro-Q染色及Western Blot结果,我们发现BL0033的磷酸化反应,并且确定了其磷酸化发生于丝氨酸和酪氨酸残基,其中一个主要磷酸化位点位于丝氨酸残基,其余四个磷酸化位点位于酪氨酸残基。 生物信息学分析表明,BL0033属于一个糖ABC转运系统,该系统共有四个组成蛋白:BL0033、BL0034、BL0035、BL0036。其中BL0033被注释为可能的ABC转运系统中的糖结合蛋白,BL0034被注释为ABC转运系统中的ATP结合蛋白,BL0035和BL0036被注释为ABC转运系统的透性酶。果糖、木糖、核糖、葡萄糖浓度梯度和时间梯度的比较蛋白质组学研究,显示BL0033能够被果糖、木糖和核糖诱导表达,并且果糖对其诱导具有明显的特异性和可逆性。同时,半定量RT-PCR结果显示BL0034、BL0035和BL0036在转录水平也具有较显著的提高,暗示BL0033-BL0036可能是一个果糖、木糖、核糖ABC转运系统。 为了验证BL0033、BL0034、BL0035和BL0036的生物学功能,先后用毛细管电泳、ATP结合实验、超滤纯化等实验方法进行了这些蛋白的表达纯化及功能验证。通过毛细管电泳技术,发现BL0033能够结合果糖、木糖和核糖,并且表现出对果糖的高结合特性,BL0035和BL0036均能结合果糖、木糖、核糖;通过ATP结合实验,证实BL0034有ATP结合特性。 BL0033、BL0034、BL0035、BL0036作为一个可能的糖转运ABC系统,在发挥转运底物的生理功能时,必然存在着相互作用。进一步表达和纯化分别含有GST标签和His标签的这个系统的所有蛋白,应用GST pull-down和Western Blot,分别验证了四种蛋白之间存在着两两相互作用。为了进一步研究BL0033和BL0034相互作用时的作用位点,构建了带有His标签的BL0033和BL0034的截短突变体:BL0033/1-23、BL0033/36-314、BL0034/8-244、BL0034/33-220和BL0034/289-481,分别代表了两个蛋白的不同的基序。从GST pull-down和Western Blot的结果分析来看,BL0033的1-23aa基序是BL0033与BL0034发生作用的区域,而BL0034的33-220aa基序则是BL0034与BL0033发生作用的氨基酸区域。BL0033的1-23aa结构域包含一个DNA重组介质氨基酸序列,可以与BL0034的包含有ATP结合序列的33-220aa氨基酸区域相结合。而且进一步的Pro-Q染色结果表明,BL0033的36-314aa氨基酸序列,在翻译后修饰的过程中被磷酸化,这个结构域部分应该包含有果糖、木糖、核糖的结合蛋白,表明该3种糖底物可以引起BL0033在底物结合时的磷酸化反应,从而激活转运过程,将底物从胞外转移至胞内。 通过上述实验过程及结果,BL0033作为底物结合蛋白,BL0034作为ATP结合蛋白,BL0035、BL0036作为底物转运蛋白,符合一个典型的ABC转运系统的所有构件组成,并且存在整个系统发挥生物学功能时的相互作用,结合基因学上的相关性,因此我们提出了一个新的糖结合蛋白ABC转运系统,命名为B. longum NCC2705中的果糖ABC转运系统。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R378

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