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《中国人民解放军军事医学科学院》 2011年
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荧光素酶标记的HCV细胞模型的建立及其在药物评价等方面的应用

高博  
【摘要】:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是慢性肝病的主要原因。目前全世界有约1.7亿人感染HCV,每年新增感染者3至4百万。大多数HCV感染者会发展成持续感染,这与肝硬化和肝癌的高风险密切相关。HCV严重地威胁着人类的健康。目前临床标准治疗HCV主要采用聚乙二醇干扰素和利巴韦林的联合疗法,但只有约50%的患者能够产生持续病毒学应答(SVR)。因此,发展高效的抗HCV药物具有重大意义。 自从发现HCV以来,由于缺乏良好的模型系统,阻碍了对这种病毒的全方面的认识。然而,在过去这十年中,已大大加快了各种体外细胞模型系统的发展。这些系统已对HCV的研究领域产生重大影响,使我们对HCV复制和感染的机制有了一定了解。重要的是,体外细胞模型系统已为很多新的治疗HCV慢性感染的抗病毒药物临床前评价提供了帮助。 目前HCV复制系统和细胞感染系统是体外细胞模型研究领域的热点。对此,本课题在引进HCV亚基因复制子的基础上,建立并完善荧光素酶标记的HCV亚基因组复制细胞模型,并在HCV和全基因组感染克隆上引入抗性基因neo,建立了荧光素酶标记的HCV全基因组感染细胞模型。利用两种细胞模型对IFN-α、cyclosporine A(CsA)、sorafenib三种药物的抗HCV效果进行了系统的评价,并在抗病毒免疫机制研究方面进行了一些尝试。具体研究内容和结果如下: 1.以萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Fluc)标记的HCV亚基因组复制子质粒Luc-Ubi为模板,体外转录获得RNA,通过高效转染试剂DMRIE-C,将RNA转染至Huh7.5.1中,经过G418加压筛选到克隆。通过荧光素酶活性检测,筛选到的细胞克隆具有高水平的Fluc活性,通过Western blot检测到HCV NS5A蛋白的表达。上述实验表明建立了稳定的荧光素酶标记的HCV亚基因组复制细胞模型。 2.将抗性基因neo引入Fluc标记的HCV全基因组质粒Luc-JC1中,构建出Luc-JC。用DMRIE-C转染试剂将HCV全基因组Luc-JC RNA转染至Huh7中,经过G418加压筛选到克隆。通过荧光素酶活性、间接免疫荧光、Western blot、荧光定量PCR检测(FQ-PCR)、HCV NS3/4A对eYFP-MAVS的切割实验,分别检测到细胞克隆中Fluc报告基因、core、NS3、NS5A、NS3/4A蛋白和病毒RNA的表达。上述实验表明建立了稳定的荧光素酶标记的HCV全基因组感染细胞模型。 3.分别用IFN-α、CsA、sorafenib处理荧光素酶标记的复制细胞,通过荧光素酶活性检测发现,随着三种药物浓度的增加,荧光素酶活性逐渐降低。在荧光素酶标记的感染细胞药物评价实验中,通过荧光素酶活性、Western blot、荧光定量PCR等检测发现,随着这三种药浓度的增加,荧光素酶活性、HCV相关蛋白表达量、HCV RNA拷贝数逐渐降低。通过以上的一系列实验证明,IFN-α、CsA、sorafenib对HCV的复制有明显的抑制作用,而且这种抑制作用具有剂量依赖性,抑制效果IFN-αCsAsorafenib。联合用药实验初步表明,IFN-α与CsA联合使用对HCV的抑制具有协同作用,而IFN-α与sorafenib联合使用对HCV的抑制具有拮抗作用,但是其作用机理还需进一步研究。实验证明,荧光素酶标记的HCV复制和感染细胞模型能够用于药物评价,反之,通过药物评价实验,进一步证明了模型的可靠性和实用性。 4. HCV复制和感染细胞模型不仅应用于药物评价、筛选方面,而且还极大地促进了HCV致病机制方面研究。在体外,应用建立的HCV感染细胞模型,初步证明HCV能切割MAVS,明显抑制IFNβ启动子的激活。用定量的蛋白质相互作用检测方法探究HCV NS3/4A和NS4B参与抑制天然抗病毒免疫机制。结果初步显示,HCV NS3/4A和NS4B都能抑制MAVS-TAF3的相互作用。此外,NS4B作用于IRF3上。在体内,将荧光素酶标记HCV的感染细胞皮下移植SCID-beige小鼠后,报告基因标记的感染克隆通常在短期内被机体清除。由此推测抑制HCV在体内感染的因素可能与天然免疫有关。为了验证这种假设,采用RT-PCR、Western blot检测到移植瘤中IFN及其活化基因的表达,初步证实移植到小鼠皮下的HCV感染细胞能激活小鼠机体天然免疫抗病毒免疫反应。对比Huh7对照细胞移植到体内后ISG15的表达水平同样明显升高,说明移植到小鼠皮下的HCV复制和感染细胞中Fluc报告基因消失可能是由于小鼠机体对移植细胞产生的非特异性天然抗病毒免疫反应,而非针对移植细胞中HCV的特异性天然抗病毒免疫反应。 总之,本研究成功建立了荧光素酶标记的HCV亚基因组复制细胞和全基因组感染细胞模型。利用该模型对抗HCV药物效果进行了评价,并在抗病毒免疫机制研究方面进行了尝试,为抗病毒药物进行高通量筛选、HCV致病机制研究和HCV细胞移植小鼠模型建立奠定了前期基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R512.62

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