基于G-四链体结构的HIV-1进入抑制剂的研究

【摘要】：研究发现,人体基因组中存在大量富含G的序列,它们能够形成稳定的G-四链体结构,参与着众多重要的生理过程,G-四链体也因此作为某些疾病的治疗靶点被大量研究。同时作为一个能在体内稳定存在的分子,G-四链体可以特异性结合某些蛋白,具有治疗疾病的潜力。本课题的设计即充分利用了四链体的稳定性及其活性特征进行研究。 寡聚脱氧核苷酸序列5’-d (TGGGAG)-3’在含K+的溶液中能够形成稳定的G-四链体结构,而且当序列的5’-末端接入一个大的芳香性基团时,序列具有很好的抑制HIV-1进入的细胞活性。本课题选用5’-d (TGGGAG)-3’,5’-末端引入DMTr作为阳性对照,通过对序列的碱基进行修饰和改变序列的组成,以得到稳定性更好,活性更高的化合物。 基于5’-d (TGGGAG)-3’的结构-活性关系,本课题将大的芳香性基团叔丁基二苯基硅基(TBDPS)引入到碱基T和G上,合成了9个核苷类似物及其亚磷酰胺单体,其中的单体LK-CW-712, 813, 1202, 1102, 1003, 1303为新合成的单体,其它单体为本课题组其他成员合成。 课题的设计包含以下五个方面:首先,我们在不影响G-四链体形成的前提下,在5’-端的碱基T上引入TBDPS,探讨芳香性基团的位置被进一步优化的可能性,同时选用亚甲基、亚乙基、亚丙基作为芳香性基团与碱基的连接臂。活性结果表明芳香性基团的位置对活性影响不大,将芳香性基团从糖环上转移到碱基上,仍然可以得到相当的活性。同时,利用亚甲基、亚乙基、亚丙基三种连接臂对活性产生了一定的影响,说明芳香性基团在四链体结构的5’-端的位置具有一定的灵活性;其次,增加芳香性基团的数量和体积,在5’-末端羟基位点以及核苷的碱基上,引入不同的芳香性基团,即在四链体分子末端引入约两倍量的芳香性结构,考察其是否对活性起到叠加的作用,活性数据表明当芳香性基团足够大时,继续增加芳香性基团的数量并不能使活性显著性提高。但是CD谱结果表明,修饰后的序列的稳定性明显提高且更易形成平行的G-四链体结构;第三,改变芳香性基团的类型,用TBDPS代替糖环上的DMTr,考察不同的芳香基团对活性是否有影响,活性结果表明活性与芳香性基团的种类关系不大;第四,改变G-四链体的结构,通过替换寡核苷酸序列5’-d (TGGGAG)-3’中的第三个碱基G,用7-去氮鸟嘌呤将其代替使其无法形成稳定的G-四链体,活性结果表明即使此时保留5’-末端的芳香性基团也不具有HIV-1进入抑制的活性。同时,用7-去氮鸟嘌呤代替序列中的碱基T且保留5’-末端的DMTr,活性能够保持;第五,使用双螺旋作为骨架。由于G-四链体序列特点是含有多个磷酸根,同时在末端疏水性基团的疏水作用力的推动下使更多的磷酸根聚集,形成了一个负离子的聚集体,而与G-四链体结合的靶蛋白gp120和CD4有一个重要特征那就是此段肽序列具有很多含氨基正离子的氨基酸片段,可以推测G-四链体与靶蛋白的结合电荷间的相互作用扮演着重要角色。本课题大胆尝试使用双螺旋作为分子骨架,设计了多条序列包括末端带有芳香性基团的双螺旋和单链、末端不带芳香性基团的双螺旋。活性结果表明:带有芳香性基团的8碱基双螺旋序列也具有HIV-1进入抑制的活性,且活性与G-四链体相当。同时,单链DNA以及末端没有芳香性基团的双螺旋DNA没有活性。 本课题对5’-d (TGGGAG)-3’系列的序列进行圆二色谱扫描,实验结果表明除了序列LK-CW-G17以外,其他序列均能形成平行四链体结构,这为构效关系的研究提供了基础。