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基于DNA条形码的我国主要蚊虫分子分类系统的建立

王刚  
【摘要】:蚊科(Culicidae)隶属于双翅目(Diptera)、长角亚目(Nematocera)。蚊类的危害不仅在于骚扰吸血,部分种类更是多种严重疾病的重要传播媒介,是重要的医学昆虫,因此它们一直受到医学昆虫学家和预防医学家的高度重视,是研究得最为广和深的昆虫类群之一。迄今为止,已知全世界有40属约3200种(亚种),我国目前记录约有18属390余种(亚种)。目前,国内外众多学者依据形态特征所建立的蚊科分类系统已经比较成熟,反映了各蚊种间的亲缘关系,然而在进化关系上,尽管众多学者以形态特征为依据用支序系统学的方法对蚊科的系统发育进行了重建,但在形态特征的选择中,不论是祖征还是新征,多少受选择者的影响,并且对于不少特征,如雌雄两性触须的长短、幼虫呼吸管的长短、鳞片色泽、是否有气门鬃等,很难估计这些特征在进化过程中代表的意义及相对重要性,并且目前的分类系统很少将生态习性这一特征考虑进去。 再者,为切实做好蚊媒病的防治和2020年消灭疟疾,蚊虫的分类鉴定工作相当重要,而目前形态学分类方法有两个方面的局限:第一是形态学分类方法本身固有的缺陷:1.表型可塑性(Phenotypic plasticity)和遗传可变性(Genetic variability)容易导致不正确的鉴定;2.形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元;3.形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制,因此很多生物无法被鉴定;第二是资深蚊虫分类学家的匮乏。因此急需的是一种快速、精确、可自动化的以及全球通用的分类鉴定工具。 在此基础上,本研究选用mtDNA-COI、mtDNA-COII、mtDNA-Cytb、rDNA-28S-D2和rDNA-28S-D3共5个分子标记,对我国主要蚊虫进行系统发育分析,重建我国主要蚊虫的系统发育关系,并分析各基因的特征,从中筛选出能作为DNA条形码的编码基因,设计并开发我国主要蚊虫分子鉴定系统。 本研究广泛采集蚊种,共采得蚊虫蚊虫15属126种(亚种),单蚊提取基因组DNA,扩增和测定mtDNA-COI、mtDNA-COII、mtDNA-Cytb、rDNA-28S-D2和rDNA-28S-D3的序列,对于测序异常的样本并做分子克隆后再送测序。应用SeqVerter、Clustal X 1.8、Primer Primiser 5.0、ModelTest 3.7、MrMTgui、MEGA 4.0、PAUP*4.0b10(PC)和MrBayes 3.1软件包分别对序列进行修正、比对、序列特征分析、建树模型选择、构建系统发育关系以及DNA条形码基因的筛选、建立DNA条形码数据库、分子鉴定系统参数值的探索。蚊科聚类关系重建采用距离法,系统发育树的重建采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯法,最后根据所得参数用VB 6.0软件开发“我国重要蚊虫分子鉴定系统”。 本研究分别获得15属124种(亚种)mtDNA-COI基因序列、15属99种(亚种)mtDNA-COII基因序列、15属92种(亚种)mtDNA-Cytb基因序列、14属81种(亚种)线粒体联合基因序列、13属62种(亚种)D2+D3联合基因序列和10属46种(亚种)五基因联合基因序列,依据3个单基因数据集和3个多基因数据组分别构建了27棵系统发育树,经SH和KH检验并联合形态和生态习性显示COI和COII基因的BI树最为合理。对各基因的序列特征和遗传距离进行分析后,筛选出COI基因作为DNA条形码编码基因,并对实验所得COI基因的415序列进行分析,对分子鉴定系统的参数进行权衡,建立分子数据库,最终选择以p-距离模型,2%遗传差异为种内阈值开发分子鉴定软件。 本研究获得如下结果。 (1)98%以上蚊虫COI基因的种内距离在2%以下,并且同种间距离无重叠,尽管COI数据偶有例外发生,但这并不妨碍蚊种的鉴别。 (2)COI分子数据提示,蚊科中背点伊蚊、刺扰伊蚊、蛛形杵蚊、华丽巨蚊和凶小库蚊中存在有隐藏种,而粗腿轲蚊和中华按蚊中发现种内的分子分化。 (3)COI分子数据显示,尖斑伊蚊和圆斑伊蚊、细刺库蚊和小型库蚊尽管有细微的形态差异,但分子遗传距离较小,提示可能不能上升到种水平。 (4)综合5个分子标记数据同形态特征和生态习性,重建了我国蚊虫的进化关系,结果显示按蚊属和直脚蚊属是最为原始的类群,而巨蚊属、蓝带蚊属、领蚊属、阿蚊属、局限蚊属、钩蚊属和杵蚊属是处于各个分支顶端的类群,并认为目前领蚊属的分类地位有待斟酌。 (5)综合5个分子标记数据,显示伊蚊属、领蚊属和阿蚊属以及曼蚊属和柯蚊属的亲缘关系,由此重新确认了原伊蚊族和原曼蚊族的进化地位,而分子数据显示库蚊属中的包蚊亚属和路蚊亚属被聚类于库蚊亚属内。 (6)以COI基因为条形码编码基因,建立了我国主要蚊虫分子鉴定数据库,开发了“我国主要蚊虫分子鉴定系统”,能成功将我国主要蚊虫鉴定到种,同时给出该蚊虫的生态习性、地理分布和医学重要性。


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