收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

运动促衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化的线粒体重构机制研究

薄海  
【摘要】:目的:骨骼肌卫星细胞成肌分化能力降低是衰老性肌萎缩发生机制之一,氧化应激是造成衰老卫星细胞成肌分化障碍的重要原因。适量运动训练可降低衰老卫星细胞内氧化应激水平,与成肌分化能力增加相关,但具体机制尚不清楚。研究表明,卫星细胞成肌分化过程也是线粒体重构的过程,且线粒体重构可逆向调控卫星细胞分化能力及定向性。我们前期工作证明,ROS过高产生氧化应激诱导线粒体异常重构,启动病理信号;而运动训练可通过适量上调ROS,发挥其信号分子效应,进而促进线粒体适应性重构,实现健康效应。本研究从ROS生理/病理双重作用角度探讨运动促衰老卫星细胞成肌分化的机制:1)建立衰老性肌萎缩小鼠模型及耐力运动训练干预模型,利用原代培养技术获得骨骼肌卫星细胞,并体外诱导分化,探讨ROS生成、线粒体重构(能量代谢、生物合成、融合分裂、嵴重构)及相关信号通路的变化规律及潜在关联;2)并以C2C12成肌细胞为研究对象,观察成肌分化各时程ROS生成、线粒体重构及相关信号通路的变化规律,以探讨生理条件下它们之间的时序关系;3)对照观察不同水平外源性H202对成肌分化中线粒体重构的影响,进一步验证“运动通过改变ROS水平和线粒体重构调控衰老卫星细胞分化”的假设;并利用mTOR特异性激动剂和阻断剂干预上述模型,探讨mTOR是否参与ROS双向调控成肌分化的切换机制。 方法:1)雄性C57BL/6小鼠48只,包括青年鼠(2月龄,24只)和老年鼠(12月龄,24只)。分为青年对照组、青年运动训练组、老年对照组和老年运动训练组。训练组小鼠进行12周跑台耐力训练。处死后计算腓肠肌湿重/体重比值,并HE染色测量肌纤维横截面积;剩余肌肉用两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度;原代培养并体外诱导成肌分化24h。倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度;Oxygraph-2k细胞呼吸测量仪测定透膜细胞中线粒体氧耗速率;荧光素-荧光素酶发光法测定ATP合成酶活性;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS水平和线粒体ROS生成速率;电镜检测线粒体超微结构;RT-PCR法检测MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHCⅡx mRNA和MyHCⅡb mRNA表达;Western-blot法检测细胞MyHC、COXⅣ、 Mfn1、OPA1、Drp1、MnSOD、 PGC-lα、AMPK、p-AMPK (Thr172)、mTOR、 p-mTOR (Ser2448)和p2l蛋白表达量;2)用低浓度马血清诱导C2C12成肌细胞分化,分别在成肌分化后0h,3h,6h,9h,12h和24h终止分化,收集细胞,测定成肌分化及线粒体重构相关指标(同前);3)建立浓度梯度H202干预C2C12成肌细胞分化模型,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR法检测MyHC mRNA表达,确定促进成肌分化的低浓度H2O2和抑制成肌分化的高浓度H2O2。在C2C12成肌细胞分化起始时分别加入高或低浓度H2O2,分化24h后检测成肌分化及线粒体重构相关指标(同前)。并在低浓度H2O2干预模型中加入雷帕霉素,在高浓度H2O2干预模型中加入亮氨酸,检测mTOR在ROS调控成肌分化通路中的角色。 结果: 一、运动和衰老对肌卫星细胞分化中线粒体重构和ROS生成的影响 本部分研究中,与青年组比较,老年组肌肉湿重/体重比值和肌纤维横截面积明显降低,表明衰老性肌萎缩模型建立成功。老年组卫星细胞体外分化24h后,肌管形成数量、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA及MyHC蛋白表达均低于青年组,提示衰老卫星细胞成肌分化能力降低。此外,老年组ST3、RCR、 MnSOD、COXⅣ、 Mfn1、L-OPA1、S-OPA1、Drp1、PGC-lα、Tfam、mTOR、 p-mTOR、p21表达均显著降低;老年组ST4、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率、p-AMPK显著升高。电镜结果显示,老年组线粒体嵴数量极少且排列紊乱。12周运动训练部分逆转了上述衰老对成肌分化、ROS生成、线粒体能量代谢、生物合成、融合分裂及嵴重构的影响。 二、C2C12成肌细胞分化进程中线粒体重构与ROS生成动态变化 本部分研究中,分化3h时,MyHC、ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、细胞ROS、线粒体ROS生成速率、MnSOD、L-OPA1、Mfn1、PGC-1α、 p-mTOR、 p-AMPK和p21即开始显著升高,且升高趋势持续至24h。分化6h时,S-OPA1和(?)nTOR表达开始升高,且升高趋势持续至24h。分化9h时,Tfam表达开始升高,且升高趋势持续至24h。ST4在分化12h和24h时开始升高。COXⅣ在分化24h时才开始明显升高。Drpl在分化6h和9h时显著升高,但在12h时开始降低,至24h时恢复至0h水平。 三、外源性H2O2对C2C12成肌细胞分化中线粒体重构的调控机制研究 在浓度梯度H2O2干预C2C12成肌细胞分化实验中,与Oμmol/L H2O2比较,100μmol/L H2O2对细胞存活率无影响,MyHC mRNA表达升高了31%;600μmol/L H2O2使细胞存活率降低了18%,MyHC mRNA表达降低了28%。我们将100μMH2O2定义促成肌分化的低水平ROS,将600μM H2O2定义抑制成肌分化的高水平ROS。进一步研究表明,与0μmol/L H2O2比较,100μM H2O2使成肌分化、线粒体呼吸速率、ATP合成、膜电位、生物合成、融合分裂、嵴重构均显著上调,加入雷帕霉素抑制甚至逆转了100μM H2O2对成肌分化和线粒体重构的促进作用;600μM H2O2使成肌分化、线粒体呼吸速率、ATP合成、膜电位、生物合成、融合、嵴重构均显著下调,加入亮氨酸部分恢复了600μM H2O2对成肌分化和线粒体重构的抑制作用。 结论: 1.耐力运动训练可通过上调mTOR和PGC-la表达,促进衰老卫星细胞成肌分化中线粒体适应性重构,包括线粒体嵴重构趋向于成熟、线粒体空间结构趋向于融合、线粒体生物合成增加。从而提高线粒体能量代谢水平,继而通过抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进衰老卫星细胞成肌分化;并通过促进MnSOD表达,降低线粒体ROS水平; 2.成肌分化进程中线粒体ROS持续性增加。成肌分化中线粒体重构的可能时序关系:①成肌分化起始时,线粒体嵴重构首先发生以促进线粒体的成熟→②线粒体开始融合形成网络→③线粒体开始分裂并从核周向细胞特定区域移动再定位→④线粒体重新趋于融合→⑤线粒体生物合成开始。提示分化早期细胞能量水平与线粒体自身呼吸速率及空间构象相关,分化早期细胞能量水平与线粒体生物合成相关; 3.低水平H202可通过活化rnTOR和PGC-la,促进衰老卫星细胞成肌分化中线粒体适应性重构,包括线粒体嵴重构趋向成熟、线粒体空间结构趋向融合、线粒体生物合成增加,能量代谢水平增加。本结果与运动作用相似,提示中等负荷耐力运动训练可能通过将ROS保持于一定水平,从而促进线粒体重构和成肌分化;高水平H202可通过抑制mTOR和PGC-1a,导致衰老卫星细胞成肌分化中线粒体重构异常,包括线粒体嵴重构障碍、线粒体空间结构趋向于分裂、线粒体生物合成减少,能量代谢水平降低。本结果与衰老作用相似,提示衰老可能通过高水平ROS抑制线粒体重构和成肌分化;


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐忠涛,周长满,鄂玲玲;干细胞因子在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞表达和发育的免疫组织化学研究[J];解剖学报;2003年05期
2 周长满,徐忠涛;巢蛋白在体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞发育过程中的表达——免疫细胞化学研究[J];神经解剖学杂志;2004年01期
3 邵素霞,马洪骏,赵春芳,张雷,郑力芬,闫蕴力,胡蔼园;EGF、bFGF和PHGF对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响[J];细胞生物学杂志;2004年04期
4 朱洪生,钟竑,张臻,卫洪超;骨骼肌卫星细胞移植对残存心肌细胞游离Ca~(2+)的影响[J];上海第二医科大学学报;2001年01期
5 徐清斌,张馥敏,杨志健,陈亦江,高翔,钱漪,马文珠;自体骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死后心衰的实验研究[J];第四军医大学学报;2003年19期
6 钟竑,朱洪生,卫洪超,张臻,崔世涛;移植方法对自体骨骼肌卫星细胞心肌再生的影响[J];上海第二医科大学学报;2000年06期
7 徐忠涛,周长满,苏剑斌,鄂玲玲;CD34在体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞发育的免疫组织化学研究[J];解剖学报;2003年03期
8 魏宽海,裴国献,金丹;骨骼肌卫星细胞的体外培养与生物学特性(英文)[J];中国临床康复;2003年29期
9 魏宽海,裴国献,金丹,王珂,陈滨,马忠立,胡罢生;体外培养的骨骼肌卫星细胞生长与分化特性的研究[J];中华创伤骨科杂志;2001年04期
10 魏宽海,裴国献,郑磊,金丹,王珂,陈滨,马忠立;rhBMP-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响[J];中华创伤骨科杂志;2001年04期
11 钟竑,朱洪生,张臻;梗死心肌骨骼肌卫星细胞移植后心肌细胞结蛋白变化[J];中国胸心血管外科临床杂志;2000年04期
12 秦子来;朱卫雄;吴立新;;多种生长因子联合使用对体外培养人骨骼肌卫星细胞免疫组化表达及分裂指数的影响[J];中国运动医学杂志;2007年06期
13 邵素霞;吕萍;赵春芳;张雷;马洪骏;;骨骼肌卫星细胞移植到大鼠体内生长发育的初步研究[J];中国老年学杂志;2006年04期
14 陈思凡;李文学;陈建玲;杨光宇;刘华章;朱伟;;大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定[J];热带医学杂志;2011年04期
15 钱漪;干细胞移植与心肌再生[J];南京医科大学学报(自然科学版);2003年01期
16 徐忠涛,周长满,鄂玲玲;GDNF和HSV-GDNF对体外培养发育的大鼠骨骼肌卫星细胞Bcl-2表达的影响[J];神经解剖学杂志;2003年03期
17 黎炜英;朱卫雄;刘丹;;bFGF、TGF-β联合使用对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响[J];武汉大学学报(医学版);2007年06期
18 夏家红,谢艾妮,徐磊,张凯伦;大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究[J];中华实验外科杂志;2005年02期
19 谢艾妮,张凯伦,夏家红,徐磊,仇玉明,郑向阳;骨骼肌卫星细胞移植后心肌梗死区血管内皮因子表达及血管新生作用[J];临床心血管病杂志;2005年05期
20 李映川;丁强;方祖军;;成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖[J];实验动物与比较医学;2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 吴嵽;陆耀飞;;机械生长因子对骨骼肌卫星细胞激活的影响研究[A];中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集[C];2010年
2 覃立立;黎小葵;王翀;;猪骨骼肌卫星细胞的分离、培养与鉴定[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
3 蒋守群;蒋宗勇;林映才;马现永;邹书通;;大豆异黄酮对岭南黄羽肉鸡骨骼肌卫星细胞增殖和抗氧化作用的影响[A];动物营养与饲料研究——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2006年
4 武书庚;苗燕;张海军;齐广海;岳洪源;;肉仔鸡胸肌和腿肌卫星细胞的培养及其表型[A];家禽营养与饲料科技进展——第二届全国家禽营养与饲料科技研讨会论文集[C];2007年
5 张佳;周杰;盛晟;邵康;吴小雪;李维新;;重组脂联素对猪骨骼肌卫星细胞脂联素及受体和MyHC基因表达的影响[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
6 王忠刚;朱晓彤;周桂炫;高萍;束刚;江青艳;;猪骨骼肌细胞对肌内脂肪聚脂和基因表达的旁分泌调控[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
7 陈新云;曾智;;干细胞移植治疗冠心病的临床应用问题[A];第十次中国中西医结合学会心血管病学术大会暨第五次江西省中西医结合学会心血管病学术大会论文汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 边艳超;鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性研究[D];内蒙古农业大学;2013年
2 魏宽海;带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的生物学特性研究[D];第一军医大学;2002年
3 王红勇;自体骨骼肌卫星细胞移植治疗MI的实验研究[D];第三军医大学;2003年
4 周锦琳;急性运动对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力和不同pH值对骨骼肌细胞胞浆Ca~(2+)代谢的影响[D];北京体育大学;2003年
5 王丽;二丁酰环腺苷酸对肥育猪胴体品质和肉质的影响及机理研究[D];东北农业大学;2009年
6 李映川;自体骨骼肌卫星细胞注射治疗女性压力性尿失禁的实验研究[D];复旦大学;2006年
7 薄海;运动促衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化的线粒体重构机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年
8 王林杰;猪糖原合成酶(GS)与糖原合成酶激酶(GSK3)基因的分离克隆、表达分析及其功能研究[D];华中农业大学;2010年
9 史新娥;FoxO1调控猪骨骼肌纤维类型分化的作用及分子机理[D];西北农林科技大学;2011年
10 熊绍虎;体外构建具有理想方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维的实验研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙婧瑜;机械生长因子对骨骼肌卫星细胞的增殖作用及作用途径的初步研究[D];上海体育学院;2010年
2 刘月光;利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化研究[D];西北农林科技大学;2011年
3 吴海青;绵羊骨骼肌卫星细胞的体外培养和诱导分化[D];内蒙古大学;2012年
4 吴嵽;MGF对骨骼肌卫星细胞激活的影响及与其增殖的量效关系[D];上海体育学院;2010年
5 鲁明;miR-206对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响研究[D];东北农业大学;2013年
6 王琼;IGF-Ⅰ与MGF对骨骼肌卫星细胞增殖及迁移的影响[D];上海体育学院;2011年
7 陈宗正;EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖分化影响及其机制的初步研究[D];西北农林科技大学;2012年
8 曹磊;十一酸睾酮对大鼠肛提肌骨骼肌卫星细胞雄激素受体的影响[D];山西医科大学;2011年
9 夏清建;自体骨骼肌卫星细胞移植治疗压力性尿失禁的可行性实验研究[D];福建医科大学;2006年
10 卢胜娟;骨骼肌特异性报告基因逆转录病毒载体的构建与验证[D];西华大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 毛天球;组织工程学研究概况[N];中国医药报;2000年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978