运动促衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化的线粒体重构机制研究

【摘要】：目的：骨骼肌卫星细胞成肌分化能力降低是衰老性肌萎缩发生机制之一,氧化应激是造成衰老卫星细胞成肌分化障碍的重要原因。适量运动训练可降低衰老卫星细胞内氧化应激水平,与成肌分化能力增加相关,但具体机制尚不清楚。研究表明,卫星细胞成肌分化过程也是线粒体重构的过程,且线粒体重构可逆向调控卫星细胞分化能力及定向性。我们前期工作证明,ROS过高产生氧化应激诱导线粒体异常重构,启动病理信号；而运动训练可通过适量上调ROS,发挥其信号分子效应,进而促进线粒体适应性重构,实现健康效应。本研究从ROS生理/病理双重作用角度探讨运动促衰老卫星细胞成肌分化的机制：1)建立衰老性肌萎缩小鼠模型及耐力运动训练干预模型,利用原代培养技术获得骨骼肌卫星细胞,并体外诱导分化,探讨ROS生成、线粒体重构(能量代谢、生物合成、融合分裂、嵴重构)及相关信号通路的变化规律及潜在关联；2)并以C2C12成肌细胞为研究对象,观察成肌分化各时程ROS生成、线粒体重构及相关信号通路的变化规律,以探讨生理条件下它们之间的时序关系；3)对照观察不同水平外源性H202对成肌分化中线粒体重构的影响,进一步验证“运动通过改变ROS水平和线粒体重构调控衰老卫星细胞分化”的假设；并利用mTOR特异性激动剂和阻断剂干预上述模型,探讨mTOR是否参与ROS双向调控成肌分化的切换机制。 方法：1)雄性C57BL/6小鼠48只,包括青年鼠(2月龄,24只)和老年鼠(12月龄,24只)。分为青年对照组、青年运动训练组、老年对照组和老年运动训练组。训练组小鼠进行12周跑台耐力训练。处死后计算腓肠肌湿重/体重比值,并HE染色测量肌纤维横截面积；剩余肌肉用两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度；原代培养并体外诱导成肌分化24h。倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度；Oxygraph-2k细胞呼吸测量仪测定透膜细胞中线粒体氧耗速率；荧光素-荧光素酶发光法测定ATP合成酶活性；JC-1荧光探针检测线粒体膜电位；DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS水平和线粒体ROS生成速率；电镜检测线粒体超微结构；RT-PCR法检测MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHCⅡx mRNA和MyHCⅡb mRNA表达；Western-blot法检测细胞MyHC、COXⅣ、 Mfn1、OPA1、Drp1、MnSOD、 PGC-lα、AMPK、p-AMPK (Thr172)、mTOR、 p-mTOR (Ser2448)和p2l蛋白表达量；2)用低浓度马血清诱导C2C12成肌细胞分化,分别在成肌分化后0h,3h,6h,9h,12h和24h终止分化,收集细胞,测定成肌分化及线粒体重构相关指标(同前)；3)建立浓度梯度H202干预C2C12成肌细胞分化模型,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR法检测MyHC mRNA表达,确定促进成肌分化的低浓度H2O2和抑制成肌分化的高浓度H2O2。在C2C12成肌细胞分化起始时分别加入高或低浓度H2O2,分化24h后检测成肌分化及线粒体重构相关指标(同前)。并在低浓度H2O2干预模型中加入雷帕霉素,在高浓度H2O2干预模型中加入亮氨酸,检测mTOR在ROS调控成肌分化通路中的角色。 结果： 一、运动和衰老对肌卫星细胞分化中线粒体重构和ROS生成的影响 本部分研究中,与青年组比较,老年组肌肉湿重/体重比值和肌纤维横截面积明显降低,表明衰老性肌萎缩模型建立成功。老年组卫星细胞体外分化24h后,肌管形成数量、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA及MyHC蛋白表达均低于青年组,提示衰老卫星细胞成肌分化能力降低。此外,老年组ST3、RCR、 MnSOD、COXⅣ、 Mfn1、L-OPA1、S-OPA1、Drp1、PGC-lα、Tfam、mTOR、 p-mTOR、p21表达均显著降低；老年组ST4、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率、p-AMPK显著升高。电镜结果显示,老年组线粒体嵴数量极少且排列紊乱。12周运动训练部分逆转了上述衰老对成肌分化、ROS生成、线粒体能量代谢、生物合成、融合分裂及嵴重构的影响。 二、C2C12成肌细胞分化进程中线粒体重构与ROS生成动态变化 本部分研究中,分化3h时,MyHC、ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、细胞ROS、线粒体ROS生成速率、MnSOD、L-OPA1、Mfn1、PGC-1α、 p-mTOR、 p-AMPK和p21即开始显著升高,且升高趋势持续至24h。分化6h时,S-OPA1和(?)nTOR表达开始升高,且升高趋势持续至24h。分化9h时,Tfam表达开始升高,且升高趋势持续至24h。ST4在分化12h和24h时开始升高。COXⅣ在分化24h时才开始明显升高。Drpl在分化6h和9h时显著升高,但在12h时开始降低,至24h时恢复至0h水平。 三、外源性H2O2对C2C12成肌细胞分化中线粒体重构的调控机制研究 在浓度梯度H2O2干预C2C12成肌细胞分化实验中,与Oμmol/L H2O2比较,100μmol/L H2O2对细胞存活率无影响,MyHC mRNA表达升高了31%;600μmol/L H2O2使细胞存活率降低了18%,MyHC mRNA表达降低了28%。我们将100μMH2O2定义促成肌分化的低水平ROS,将600μM H2O2定义抑制成肌分化的高水平ROS。进一步研究表明,与0μmol/L H2O2比较,100μM H2O2使成肌分化、线粒体呼吸速率、ATP合成、膜电位、生物合成、融合分裂、嵴重构均显著上调,加入雷帕霉素抑制甚至逆转了100μM H2O2对成肌分化和线粒体重构的促进作用；600μM H2O2使成肌分化、线粒体呼吸速率、ATP合成、膜电位、生物合成、融合、嵴重构均显著下调,加入亮氨酸部分恢复了600μM H2O2对成肌分化和线粒体重构的抑制作用。 结论： 1.耐力运动训练可通过上调mTOR和PGC-la表达,促进衰老卫星细胞成肌分化中线粒体适应性重构,包括线粒体嵴重构趋向于成熟、线粒体空间结构趋向于融合、线粒体生物合成增加。从而提高线粒体能量代谢水平,继而通过抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进衰老卫星细胞成肌分化；并通过促进MnSOD表达,降低线粒体ROS水平； 2.成肌分化进程中线粒体ROS持续性增加。成肌分化中线粒体重构的可能时序关系：①成肌分化起始时,线粒体嵴重构首先发生以促进线粒体的成熟→②线粒体开始融合形成网络→③线粒体开始分裂并从核周向细胞特定区域移动再定位→④线粒体重新趋于融合→⑤线粒体生物合成开始。提示分化早期细胞能量水平与线粒体自身呼吸速率及空间构象相关,分化早期细胞能量水平与线粒体生物合成相关； 3.低水平H202可通过活化rnTOR和PGC-la,促进衰老卫星细胞成肌分化中线粒体适应性重构,包括线粒体嵴重构趋向成熟、线粒体空间结构趋向融合、线粒体生物合成增加,能量代谢水平增加。本结果与运动作用相似,提示中等负荷耐力运动训练可能通过将ROS保持于一定水平,从而促进线粒体重构和成肌分化；高水平H202可通过抑制mTOR和PGC-1a,导致衰老卫星细胞成肌分化中线粒体重构异常,包括线粒体嵴重构障碍、线粒体空间结构趋向于分裂、线粒体生物合成减少,能量代谢水平降低。本结果与衰老作用相似,提示衰老可能通过高水平ROS抑制线粒体重构和成肌分化；