收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

TEM8与uPA的相互作用及其生物学意义研究

张连成  
【摘要】:血管生成是从组织中已存在的成熟血管发展形成新的毛细血管网络的过程,在包括胚胎发育、伤口愈合、组织再生和重塑等许多重要的生理过程是必不可少的。然而失控的或有缺陷的血管生成也存在于各种疾病,包括肿瘤、心血管疾病以及增生性视网膜疾病的病理过程中。靶向血管生成疗法可以被用来终止或延缓这些疾病的发展,所以这种治疗方法已经引起了科学界极大的关注。然而在临床应用中靶向血管生成的抗肿瘤药物被证明只有有限的疗效,同时还存在很大的副作用,于是寻找更特异性的血管生成标志物变得更加迫切。肿瘤内皮标志物Ⅷ(tumor endothelial marker8,TEM8)是一种特异性表达于肿瘤脉管系统且物种间高度保守的Ⅰ型膜蛋白。后来的研究发现TEM8是炭疽毒素保护性抗原(PA)的受体,作为炭疽毒素的“帮凶”,介导其进入宿主细胞。关于TEM8生理功能方面的研究则相对滞后了很多,仅有一些研究发现TEM8在肿瘤细胞的迁移、粘附和肿瘤血管生成等生理过程中发挥关键性作用,tem8基因敲除小鼠实验也证明TEM8对促进肿瘤血管生成和肿瘤生长起到重要作用,而对正常的生长发育和伤口愈合没有任何影响。TEM8这种特异性的分布以及在正常和肿瘤血管形成中功能的差异性,引起了极大关注。在最近的一篇临床前研究中发现,靶向TEM8胞外结构域的抗体能够抑制肿瘤血管的生成以及多种植入到小鼠体内的人肿瘤细胞的生长和迁移,这种抗TEM8抗体能够增强其他抗血管生成剂、血管靶向剂以及传统化疗药物的活性,并且没有发现其存在细胞毒性。 本课题组在前期工作中开发了一种抗体样分子TEM8-Fc (TEM8N端与炭疽毒素保护性抗原PA结合的vWA结构域和IgG1Fc段组成的融合蛋白),发现它是一种具有抗血管生成能力的分子,能抑制多种肿瘤细胞的生长、迁移以及肿瘤血管的生成,然而其抑制肿瘤的机制尚未阐述清楚。为了弄清TEM8-Fc的抑瘤机制,首先需要弄清TEM8的生理性配体及其发挥生理功能的作用机制。本研究将研究焦点首先集中在关于TEM8生理性配体的研究上,因为只有找到它的生理性配体才能进一步阐明它在细胞生理条件下的功能作用,为靶向TEM8的肿瘤抗血管生成疗法提供理论依据。在找到TEM8的生理性配体后,又进一步研究了TEM8-Fc抗肿瘤血管生成的机制以及TEM8发挥生物学功能的机制。 在研究中我们得出了如下结论: 1.通过软琼脂克隆形成实验发现,TEM8和CMG2(特别是TEM8)能够使HEK293细胞的软琼脂克隆形成能力增加,即过表达TEM8或CMG2使HEK293细胞具有了恶性转化的特征。通过CCK8细胞增殖实验和划痕实验等验证了TEM8和CMG2的部分生理功能:TEM8促进细胞迁移,而CMG2促进细胞增殖。 2.利用本课题组前期构建的抗体样分子TEM8-Fc与人肝癌组织匀浆液进行免疫共沉淀和SDS-PAGE电泳,把共沉下的蛋白条带经生物质谱分析发现了TEM8的两个可能的相互作用蛋白——尿型纤溶酶原激活剂(uPA)与α-烯醇化酶(α-enolase)。因为uPA是胞外可溶性的信号分子,而α-enolase主要在胞内和胞膜上发挥功能,所以推测uPA即是TEM8的生理性配体,于是下一步工作主要围绕uPA与TEM8展开。为了进一步确定两者之间的相互作用,我们先后用ELISA、WesternBlot等方法进行了验证,并且通过表面等离子体共振(SPR)的方法测定了TEM8-Fc与uPA的结合常数。TEM8-Fc结合到高分子量单链uPA(HMW-scuPA),高分子量双链uPA(HMW-tcuPA)和低分子量uPA(LMW-uPA)的结合常数分别为16.6nM,29.7nM和31.1nM。另外还通过溶圈实验和S2444发色底物法发现与TEM8的结合不会影响uPA的酶活性。 3.构建了uPA的几种截短突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,同时构建了TEM8胞外区(N端)与RFP的融合蛋白表达载体,然后将各种uPA截短突变体与EGFP的融合蛋白表达载体和TEM8胞外区(N端)与RFP的融合蛋白表达载体分别共转染到HEK293细胞中。最后通过FRET的方法确定了uPA与TEM8之间的相互作用区域。FRET的结果显示uPA的Kringle区和酶活性区的C端与TEM8的N端有FRET效应,即介导uPA与TEM8相互作用区域是它的Kringle结构域和催化结构域的C-末端。因此uPA与TEM8相互作用区域不同于uPA受体(uPAR)(uPA的EGF样结构域负责与uPAR相互作用)。 4.用IP的方法证明了uPA能够剂量依赖性的使TEM8磷酸化,而TEM8-Fc可拮抗uPA导致的TEM8磷酸化。通过Raybiotech公司的RTK磷酸化芯片和EGFR磷酸化位点芯片,发现uPA能够上调EGFR845位和1173位酪氨酸的磷酸化水平,而TEM8-Fc能拮抗它的作用。在细胞生物学方面研究了TEM8与uPA的相互作用对肿瘤生长和迁移的作用,通过迁移实验发现uPA能够显著地增加HepG2细胞的uPAR非依赖性的迁移,而TEM8-Fc能够封闭uPA的作用。最后观察到本组开发的两种抗体样分子TEM8-Fc和ATF-Fc具有协同抗肿瘤的作用。 综上所述,本研究结果表明TEM8是uPA一种新型的受体,在调节肿瘤的生长和转移中起到了重要的作用。本组开发的抗体样分子TEM8-Fc正是通过封闭TEM8与uPA的相互作用来达到抗肿瘤血管生成的作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐海亚;;TEM治疗直肠肿瘤的手术配合[J];护理实践与研究;2011年07期
2 郝宏党;陈晓琳;蔡硕;蔡玉文;;TEM观察益肺饮诱导肺癌细胞凋亡[J];中华中医药学刊;2007年07期
3 罗泽;;直肠癌的外科手术治疗进展[J];四川生理科学杂志;2008年04期
4 赵三军;陈吉华;沈丽娟;;粘结面润湿度对牙本质粘结界面纳米渗漏的影响[J];中国美容医学;2008年07期
5 孙东辉;佟伟华;胡海燕;王权;所剑;;腹腔镜联合TEM器械结肠次全切除治疗慢传输型便秘的腹部无切口手术方法[J];医学信息(中旬刊);2010年04期
6 郭小兵;王鹏;;产ESBLs菌株的TEM型基因检测及其标本分布[J];河南职工医学院学报;2007年03期
7 田彦玲;王玉花;程建新;刘京生;;牛黄天龙胶囊(含药血清)诱导人子宫内膜癌HEC-B细胞凋亡及其机制[J];肿瘤防治研究;2006年06期
8 廖经忠;刘文恩;李虹玲;简子娟;邹明祥;;革兰阴性杆菌TEM型β-内酰胺酶耐药基因研究[J];中国现代医学杂志;2010年13期
9 金英姬,宋今丹;UPA在大肠癌中的表达及其与肿瘤侵袭的关系[J];中国肿瘤临床;1998年09期
10 黄志杰;许小晶;邝荔;欧阳健明;;纳米粒度仪研究尿石症患者和正常人尿液中的纳米微晶[J];功能材料;2009年03期
11 阎志勇;高晓群;郭小兵;;郑州地区ESBLs基因型分布研究[J];医药论坛杂志;2008年02期
12 苟建军;;TEM型超广谱β-内酰胺酶的载体构建及其表达[J];医药论坛杂志;2009年15期
13 鲍晨辉;赵滢;王强;;胃肠道间质瘤(GIST)中TGF-β_1与uPA的表达和相关性研究[J];现代肿瘤医学;2011年03期
14 周幽心!215006,叶明!215006,周岱!215006,黄煜伦!215006,鲍耀东!215006,杜子威!215006;尿激酶型纤溶酶原激活剂及其受体在胶质瘤中的表达[J];中华神经外科杂志;2001年05期
15 陈剑;赵洪洋;种衍军;;尿激酶型纤溶酶原激活因子在人脑胶质瘤中的表达和意义[J];济宁医学院学报;2006年01期
16 周裕德;;脂质体作为药物—生物膜相互作用的研究模式[J];医学分子生物学杂志;1979年01期
17 吴少林;人类红细胞中钙和铅的相互作用[J];中国职业医学;1981年02期
18 段民江;亚德里亚霉素引起急性心肌抑制作用[J];国外医药.抗生素分册;1982年03期
19 泮以正;;苯妥英钠地塞米松的相互作用:[J];国际神经病学神经外科学杂志;1982年03期
20 宋锦平;;口服避孕药的相互作用[J];药学实践杂志;1983年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱松涛;;大深度井中三分量TEM新方法的应用[A];中国地球物理2010——中国地球物理学会第二十六届年会、中国地震学会第十三次学术大会论文集[C];2010年
2 彭明生;苑执中;杨志军;蒙宇飞;张恩;李勋贵;;56彩色金刚石的透射电子显微镜(TEM)研究[A];中国矿物岩石地球化学学会第13届学术年会论文集[C];2011年
3 张翔宇;赵华;;月球结构探测中的TEM正演模拟结果初探[A];第二十三届全国空间探测学术交流会论文摘要集[C];2010年
4 刘凡隆;徐向明;林建江;;直肠肿瘤经肛微创手术——TEM临床应用初步体会[A];2011年浙江省微创外科学术会议论文汇编[C];2011年
5 尹美杰;陈江华;;2024铝合金中S相析出演化规律的TEM研究[A];第七届中国功能材料及其应用学术会议论文集(第7分册)[C];2010年
6 孔峰;吕景波;王兴权;;微乳液法合成卤化物纳米粒子[A];中国有色金属学会第十二届材料科学与合金加工学术年会论文集[C];2007年
7 张波;周杨韬;马秀良;;不锈钢中硫化锰夹杂的局域溶解及亚稳态点蚀的原位(外环境、阳极电位极化条件下)TEM研究[A];中国腐蚀电化学及测试方法专业委员会2012学术年会论文集[C];2012年
8 韩靖龙;安风雷;;瞬变电磁法(TEM)和激发极化法在钼矿勘探中的应用[A];河南地球科学通报2011年卷(下册)[C];2011年
9 于海华;刘波;陈景波;夏立建;;50例pT1直肠癌经肛内镜显微手术(TEM)治疗总结[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
10 刘凡隆;徐向明;林建江;;直肠肿瘤局部切除新术式——经肛门内镜微创手术TEM[A];2011年浙江省肛肠外科学术大会暨结直肠肛门疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张连成;TEM8与uPA的相互作用及其生物学意义研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年
2 尚新磊;TEM-MRS联用地下水探测关键技术研究[D];吉林大学;2010年
3 伍文义;布依族《摩经》语言文化研究[D];上海师范大学;2012年
4 黄涛;异步轧制高纯铝箔织构控制的研究[D];东北大学;2006年
5 黄宝旭;氮、铌合金化孪生诱发塑性(TWIP)钢的研究[D];上海交通大学;2007年
6 蔡晨光;ATR/TEM8 vWA结构域与PA的相互作用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
7 林秀;EBPVD制备Y_2O_3弥散强化FeCrAl薄板力学行为及微观结构[D];哈尔滨工业大学;2010年
8 林秀;EBPVD制备Y_2O_3弥散强化FeCrAl薄板力学行为及微观结构[D];哈尔滨工业大学;2010年
9 张晓丹;钢帘线钢丝冷拉拔过程中组织演变的定量研究与力学性能[D];清华大学;2009年
10 孙博;基于TEM模的高增益超宽带天线研究[D];哈尔滨工业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谭飞亚;TEM接收线圈的研制[D];吉林大学;2010年
2 张科科;TEM8写作内容效度研究[D];山东大学;2010年
3 李小娟;楚雄地区产β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药性和TEM耐药基因及其所致感染性疾病研究[D];大理学院;2013年
4 杨洋;合金化及工艺参数对铝热法制备的块体纳米晶Fe_3Al组织的TEM研究[D];兰州理工大学;2010年
5 史斌;早期直肠癌ERUS分期及TEM切除的临床应用研究[D];泰山医学院;2011年
6 王莹;胆固醇在PAMAM介导的基因传递过程中的作用[D];天津大学;2008年
7 常文凯;经肛门内镜显微手术治疗直肠癌与经肛门直肠肿物局部切除治疗60例报告[D];山西医科大学;2007年
8 崔巍;TEM接收机低噪声前置放大器的研究与设计[D];吉林大学;2010年
9 苑彩平;喷射沉积Al11.3Zn2.4Mg1.1Cu合金组织及性能研究[D];内蒙古工业大学;2007年
10 黄建华;碳纳米管表面化学镀Co的研究[D];南昌大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 孙世高;TEM非开挖检测技术提高管道检测时效[N];中国石化报;2010年
2 郭信麟;内外市场相互作用 港股波动难免[N];中国证券报;2007年
3 ;中西药相互作用的机理(一)[N];农村医药报(汉);2006年
4 记者  董映璧;日精确计算出核子之间的强排斥相互作用[N];科技日报;2007年
5 ;中西药相互作用的机理(二)[N];农村医药报(汉);2006年
6 武都区汉王中学教师 张登云;如何发挥课堂教学中的相互作用[N];陇南日报;2007年
7 记者 师啸 通讯员 于承海;推倒围墙走向市场[N];中国石油报;2002年
8 睢阳区路河乡第一初级中学 吴卫星;谈谈经济与文化、道德的相互作用[N];商丘日报;2010年
9 肖丽;草药+NSAIDs有潜在危险[N];健康报;2006年
10 三明市列东中学 余雪璐;电荷或磁极间相互作用演示托架[N];福建科技报;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978