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《中国人民解放军军事医学科学院》 2016年
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志贺菌CRISPR系统遗传多态性及其免疫与调控功能的研究

杨超杰  
【摘要】:志贺菌(Shigella spp.)是一类引起细菌性痢疾的重要肠道致病菌,每年感染人数接近1.67亿,其中有100万病例因此病导致死亡,而且大部分的感染病例为5岁以下的儿童。这一病原菌主要流行于发展中国家,引起流行的主要因素是当地较差的卫生环境、以及高昂的抗生素费用。在19世纪40年代,志贺菌就已经被区分为4个不同的亚群,而且每个不同的亚群根据其O抗原结构的不同又能够被区分为不同的亚型:痢疾志贺菌(17个亚型),福氏志贺菌(16个血清型),鲍氏志贺菌(18个亚型)和宋内志贺菌(1个亚型)。而且志贺菌在其发现之初就认为与大肠杆菌进化亲缘关系较近,而且近年来越来越多分子水平的证据也支持这一观点,甚至有分析指出志贺菌应该归为大肠杆菌的一个致病变种。成簇规律的短回文重复序列(CRISPR)结构最早是在1987年于大肠杆菌中被发现,它的主要结构是由长度为24-47bp的重复序列及其中穿插着的21-72bp的间隔序列组成的R-S单元,也被称为一个CRISPR位点,间隔序列被认为主要来源于外界的基因元件,而且在不同的细菌中一般具有不同的间隔序列排列。与R-S单元相邻的是前导序列和Cas蛋白基因序列,其产物在CRISPR系统发挥功能的过程中发挥重要作用。在CRISPR系统的实际功能被发现之前,这一结构就被用来对细菌进行分子分型,在结核分枝杆菌、沙门氏菌及鼠疫耶尔森氏菌中均开发了基于CRISPR结构进行分型的方法。在被发现的20年之后,CRISPR结构终于被证明在抵抗外界基因元件如质粒或噬菌体的过程中发挥适应性的免疫功能。而且随着研究的不断深入,人们发现其不仅仅具有免疫功能,在对细菌的代谢、毒力以及群体行为方面也发挥了重要的调节作用。本研究的目的是分析志贺菌这一重要的医学病原菌中存在的CRISPR系统遗传多态性,包括其CRISPR位点及其相邻的CRISPR-Cas蛋白,并通过这些分析来了解志贺菌中的CRISPR结构是否适合作为志贺菌快速检测及分子分型的靶标,同时在对志贺菌中CRISPR的遗传多态性进行充分了解的基础上,对其免疫功能进行研究与验证,并根据以上的研究结果探究志贺菌中的CRISPR系统是否存在对细菌的调控功能。为了分析志贺菌中CRISPR系统的遗传多态性,本研究选取了237株不同型别的志贺菌以及13株大肠杆菌进行6个CRISPR位点的PCR扩增并测序,通过以上分析使我们对不同型别的志贺菌中CRISPR系统的遗传多态性有了充分的了解,同时本研究也发现了志贺菌中crispr结构特有的r-s结构被替换的现象以及末端重复序列特殊的二级茎环结构;志贺菌各个型别之间的crispr结构均存在一定的差异性,而且这种差异性在相应的型别中是保守存在的,同时,也发现了志贺菌中特有的crispr-crf位点,基于以上结果建立了基于志贺菌crispr结构的快速检测与分子分型的新方法。在对志贺菌及大肠杆菌中的crispr位点多态性有了充分了解的基础上,通过对两个种群中的crispr结构进行比较,发现志贺菌中的大部分crispr位点在大肠杆菌中同样存在,这种共存性说明它们二者存在着较近的进化关系,为了进行更深入的研究,基于它们拥有的间隔序列的排列情况对各个型别的志贺菌及大肠杆菌进行了聚类分析,结果显示不同型别的志贺菌与大肠杆菌间的进化距离是不同的,这说明了志贺菌的各个型别虽然在表型水平属于趋同进化,但是其在基因组水平却分属于不同的自然族群。同时,在对与志贺菌存在相同crispr位点的菌种进行分析后发现了crispr系统在不同菌种间进行纵向遗传与水平基因转移的证据。这些结果说明,crispr系统可以作为对志贺菌及其它菌种进行进化分析的工具。本研究通过对志贺菌及大肠杆菌中的cas蛋白基因簇进行扩增及比较分析,发现志贺菌中的crispr系统在crispr的分类中属于i-e型,而且在宋内志贺菌的cas蛋白基因簇中分别插入了两个插入序列is600和issfl2,为了研究宋内志贺菌中的crispr是否具有正常的免疫功能,本研究采用了一种pstkst质粒无痕敲除的方法对其中存在的两段插入序列进行了无痕敲除,同时也对抑制crispr功能的hns基因进行了敲除,随后构建含有靶标序列的耐药质粒对野生株及突变株进行转化实验,结果显示恢复了crispr完整结构的突变株具有对含有靶标的质粒的剪切作用,而具有插入序列的crispr系统并不具备剪切作用。这说明插入序列的存在影响了crispr系统正常免疫功能的发挥。这一结果首次确定了插入序列能够沉默crispr系统的免疫功能。在对志贺菌crispr正常的免疫功能进行恢复的基础上,我们对crispr系统的调控功能进行了探究。通过多态性分析中对间隔序列进行的同源性分析,显示其间隔序列与其自身的染色体上的内源性基因糖原磷酸化酶glgp基因存在一定的同源性,为了探究宋内志贺菌crispr系统与其对自身基因的靶向之间存在的关系,我们首先对野生株和突变株中的crispr自身靶向的glgp基因的表达量进行了相对定量分析,显示其表达量发生了下降。随后从表型水平对突变株进行了分析,结果显示恢复了crispr完整结构的突变株△isd的生长速率发生了下降,而且取消了此突变株中hns基因的抑制作用后的突变株△isd-hns生长速率的下降更加明显,同时我们也对各个突变株进行了生化指标分析,发现恢复了CRISPR完整结构的突变株中与生长代谢相关的指标发生了下降。说明CRISPR系统在恢复其结构之后,志贺菌很有可能通过对自身基因的靶向对其自身的生长产生了一定的抑制作用,从而提示了CRISPR系统对细菌的调控方式。为了更进一步从蛋白水平对突变株中发生的变化进行分析,本研究利用了基于iTRAQ技术的比较蛋白组学研究对突变株中发生变化的蛋白进行了分析,结果显示突变株△ISD中下调的蛋白种类要高于其它的突变株,而且对这些差异蛋白进行GO聚类分析及KEGG通路分析,显示其中绝大多数与细菌的能量代谢相关,说明CRISPR系统结构的恢复影响了宋内志贺菌多种蛋白基因的表达,从蛋白水平确定了CRISPR系统与志贺菌代谢调控之间的相关性。综上所述,本研究通过全面系统的分析,已经对志贺菌中的CRISPR系统有了充分的了解,同时也确定了志贺菌中的CRISPR系统可以作为志贺菌快速检测及分子分型的靶标;并在多态性分析的基础上,对各个型别中的CRISPR位点进行聚类分析也确定志贺菌中的各个型别在基因组水平并不属于真正的自然族群,也证明了CRISPR系统可以作为研究志贺菌、大肠杆菌以及其它细菌之间进化关系的工具;同时也通过对志贺菌中CRISPR完整结构的恢复,验证了其正常的免疫功能;对突变株的表型及比较蛋白组学的分析发现了CRISPR系统对志贺菌代谢调控作用的方式,也为进一步研究CRISPR系统对细菌的调控功能提供了研究的方向。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R378.25

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