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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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染色质三维结构调控干扰素诱导基因的表达

李平  
【摘要】:随着染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture,3C)及其衍生技术的发明以及在染色质高级结构研究领域的广泛应用,人们逐渐对染色质的三维结构有了更深入的了解,进而认识到染色质的三维结构并不是随机和杂乱的,而是逐步折叠形成染色质领域、开放/沉默染色质聚集区、拓扑相关结构域和染色质loop结构等具有一定规律和层次的高级结构。进一步人们还发现,染色质的三维结构与基因的表达调控是密切相关的。基因的启动子和终止子间的基因loop结构保证转录方向的唯一性和RNA聚合酶的循环利用,远距离的增强子和沉默子分别通过与启动子间的相互作用激活和抑制基因的转录,绝缘子间的相互作用和拓扑相关结构域隔离内部的调控元件,使之不干扰外部的基因的表达。功能相关的基因借助转录工厂协同表达协同调控,。干扰素(Interferon,IFN)是一种广谱的抗病毒蛋白,但是其本身并没有直接的抗病毒作用,而是通过JAK-STAT信号通路激活众多干扰素诱导基因的表达,进而利用干扰素诱导基因表达的蛋白在病毒的进入、复制、转录、翻译和释放等各个过程对病毒产生抑制作用。尽管已经有较多的文献表明干扰素基因的表达调控需要染色质三维结构的参与,但是,对于染色质三维结构对干扰素诱导基因的表达调控还没有文献报道。因而,我们的科学问题就是:染色质三维结构在干扰素诱导基因的表达调控中发挥着什么样的作用?为回答这一科学问题,我们主要以干扰素诱导基因IFITM(Interferon-Induced Transmembrane protein)和MX1(Myxovirus resistance protein 1)为研究对象,在解析局部染色质构象或扫描全基因组范围相互作用的基础上,对其表达调控机制进行了一系列的研究。第一部分:干扰素诱导的增强子通过远距离相互作用协同调控IFITM1,2和3基因的表达人类IFITM1,2和3基因位于11号染色体上,成簇存在。它们在多种组织和细胞中都有本底表达,并且能够被干扰素大量诱导表达。IFITM蛋白能够通过抑制内吞体膜与病毒包膜的融合等机制抑制病毒进入细胞,对流感病毒、埃博拉病毒、登革病毒、马尔堡病毒、西尼罗河病毒、非典型肺炎冠状病毒等都有抑制作用,是广谱的抗病毒蛋白。IFITM基因编码区和调控区的核苷酸多态性可能会导致不同人群对疾病的感染的易感性不同或影响病情的严重程度。因此,研究IFITM基因的表达调控具有重要的意义,而增强子作为一类重要的基因表达调控元件,其对IFITM基因的表达调控目前还没有文献报道。我们整合ENCODE以及其它公开资源中RNA聚合酶II的Ch IA-PET相互作用、组蛋白修饰H3K4me1和K3K27ac、DNase I超敏感位点、转录因子P300、STAT1和STAT2结合位点等多种组学数据以及荧光素酶报告基因实验,首次在IFITM3启动子的上游35kb左右鉴定到一个干扰素诱导的增强子E2-3。并且,利用CRISPR在HEK293细胞中将该增强子截短、破坏了其增强子活性后,相比于野生型细胞,干扰素诱导的IFITM1,2和3基因的表达在mRNA和蛋白质水平均出现了明显下调,说明IFITM1,2和3基因是增强子E2-3的靶基因。干扰素通过JAK-STAT信号通路诱导基因的表达。利用染色质免疫沉淀技术,我们发现,干扰素处理后,干扰素信号通路相关的转录因子STAT1结合于E2-3,并且将STAT1结合motif突变后,荧光素酶报告实验表明E2-3的增强子活性下调。说明增强子E2-3的功能依赖于STAT1的结合。鉴于增强子E2-3与IFITM基因座位的距离有35kb之远,我们猜测E2-3通过与IFITM启动子的远距离的相互作用来发挥作用。HEK293和A549细胞中的3C实验验证了E2-3与IFITM1,2和3基因启动子的组成性相互作用,并且发现IFITM1,2和3基因的启动子本身之间也存在着相互作用,提示IFITM1,2和3基因可能聚集在一起,被增强子E2-3通过远距离相互作用协同调控。另外,我们还发现在增强子E2-3被截短的HEK293细胞中这些相互作用也依然存在,提示介导这些组成性的相互作用的因子可能结合于E2-3区域之外。流感感染会刺激干扰素的表达,进而诱导IFITM基因的表达,抵抗病毒的感染,因此我们在流感感染细胞的模型中,评估增强子E2-3介导的功能。用流感病毒分别感染野生型和截短增强子的HEK293细胞,我们发现虽然野生型和截短组细胞IFITM1,2和3基因的表达均出现了上调,但是截短组IFITM1,2和3基因的表达明显低于野生型组,这再次验证了增强子E2-3对IFITM基因表达的调控作用。而且,当流感病毒感染经干扰素预先处理的细胞时,截短组细胞中病毒复制得更多,说明截短增强子E2-3降低了干扰素诱导的对流感病毒的抵抗力。综上,我们第一次报道了一个调控IFITM基因表达的增强子,并且发现,该增强子通过组成性的远距离相互作用和干扰素诱导的STAT1的结合协同调控干扰素诱导的IFITM1,2和3基因的表达,进而促进干扰素诱导的对流感病毒的抵抗。这些发现显示出染色质三维结构在干扰素诱导基因表达调控中发挥着重要的功能,同时也极大地拓展了我们对于增强子在IFITM基因转录调控和干扰素抵抗病毒感染中的作用与机制的认识,进而会促进我们对于天然免疫背后复杂的机制的理解,并且为发现新的疾病易感位点以及药物作用靶点等提供了线索。第二部分:染色质三维结构参与MX1基因的表达调控人类MX1基因位于21号染色体上,可被干扰素诱导表达。MX1基因编码的MX1蛋白是一种GTPase,具有广谱的抗病毒作用,能够抑制流感病毒、Thogoto病毒、La Crosse病毒、水疱性口炎病毒、汉坦病毒和乙肝病毒等多种病毒的感染。尽管MX1在抗病毒免疫中发挥着如此重要的作用,但是目前对于MX1基因的表达调控机制的研究还比较少,特别是染色质三维结构在MX1表达调控中的作用还没有文献报道。我们利用环形染色体构象捕获结合高通量测序技术(Circular Chromosome Conformation Capture combined high-throughput sequencing,4C-seq)技术,首次获得了干扰素处理前后MX1基因启动子的相互作用谱。结果发现绝大多数相互作用是顺式相互作用,这与染色质领域的概念相一致。并且,我们还发现,一半以上相互作用是组成性相互作用,即无论干扰素处理与否,均与MX1基因启动子相互作用。为研究MX1基因相互作用片段的表观遗传学特征,我们从GEO数据库中获取了A549细胞的组蛋白修饰、组蛋白变体和转录因子的Ch IP-seq数据,进而分析了这些组蛋白修饰、组蛋白变体和转录因子在MX1基因相互作用区域的富集情况,结果发现,干扰素处理前后的相互作用区域均富集活跃的组蛋白修饰、组蛋白变体和起激活作用的转录因子,而沉默的组蛋白修饰和起抑制作用的转录因子则没有富集。说明在干扰素处理前后,MX1基因的启动子均倾向于与开放的染色质区域共定位。进一步分析干扰素处理后的相互作用片段,我们发现MX1基因上游约3.3Mb和210kb处的两个相互作用片段具有增强子样的表观遗传学修饰。利用荧光素酶报告实验,我们验证了这两个片段确实是增强子,提示这两个增强子可能在干扰素处理后通过远距离相互作用促进MX1基因的表达。并且我们还发现,将这两个增强子人为串联在一起时,其增强子作用进一步提高,说明这两个增强子在调控MX1基因表达时可能存在协同作用。许多研究表明功能相关的基因会共定位于转录工厂中协同表达。利用我们的4C数据分析MX1相互作用的基因发现,干扰素诱导基因MX2和ITSN1以及干扰素受体基因IFNAR1、IFNAR2 IFNGR2和IL10RB等均与MX1存在着广泛的相互作用,提示MX1基因与干扰素功能相关的基因很可能共定位于转录工厂协同表达。综上,我们第一次获得了干扰素处理前后MX1基因的相互作用谱,发现绝大多数相互作用是染色体内相互作用,并且相互作用片段主要是活跃的开放染色质区域,验证了染色质领域和开放/闭合染色质聚集区的存在。我们还从MX1相互作用片段中鉴定到增强子以及干扰素诱导基因和干扰素受体基因,提示启动子-增强子相互作用和转录工厂等染色质三维结构在调控MX1基因表达过程中发挥着重要的功能。这些研究为进一步探索染色质三维结构在MX1以及其它干扰素诱导基因表达调控中的作用提供了范例和参考。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78

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