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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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抗EV71病毒MAPK信号通路抑制剂的筛选及抗病毒作用的研究

张哲  
【摘要】:EV71(肠道病毒71型,Enterovirus 71)是手足口病的主要病原体之一,通常感染婴幼儿,对其生命健康具有较大的危害。尽管绝大多数情况下EV71感染所引发的疾病具有可自愈的特点,但发生重症感染时,EV71能够激活患儿体内的炎症因子风暴,导致脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎等其他致命性严重疾病的发生。目前,临床上还没有开发出针对重症感染的特效治疗药物。EV71的感染和复制需要MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)信号通路的激活,尤其是p38-MAPK信号通路,该通路对于EV71复制具有重要作用。MAPK信号通路小分子抑制剂具有出色的抗炎作用,在临床试验中被广泛应用于多种炎性疾病的治疗。考虑到EV71重症感染引发的炎症疾病,MAPK信号通路抑制药物可能能在应对EV71感染方面发挥抗病毒作用。本研究旨在筛选出具有抗EV71病毒效果的MAPK信号通路小分子抑制剂,在体内外评价药物的抗病毒作用,并探索药物的抗病毒机制。首先对包含有65种小分子抑制剂的MAPK化合物库进行筛选。病毒感染后的RNA拷贝数检测结果表明多种MAPK信号通路抑制剂表现出抑制EV71病毒复制的作用。其中,AS602801、PD169316、BRAF inhibitor、GW5074和TAK-632均能将EV71外壳蛋白VP1的RNA拷贝数抑制为对照的10%以下。p38抑制剂PD169316展现出了显著的抗病毒效应(抑制后病毒拷贝数仅为对照的2%)。PD169316与研究中普遍使用的p38抑制剂SB203580有着相似的化合物结构,然而,PD169316抑制EV71病毒复制的效果要显著优于SB203580。EV71感染24h后,5μM、10μM、20μM的PD169316能将EV71 VP1 RNA拷贝数抑制为对照的11.13%、13.65%和0.2%,而相应浓度的SB203580抑制的结果仅为65%、70%和48%。同时,EV71 VP1的蛋白水平也显著下调。EV71感染低表达p38α的HeLa细胞时,复制水平显著低于感染正常HeLa细胞。此外,细胞毒性试验表明20μM的PD169316对RD细胞没有表现出细胞毒效应。为了考察这些小分子抑制剂在动物模型中的抗EV71病毒效果,建立了EV71攻毒致死乳鼠模型。动物感染实验结果显示,EV71 GDV103株攻毒1日龄昆明乳鼠和3周龄NOD-SCID(非肥胖糖尿病-重症联合免疫缺陷,non-obese diabetic severe combined immunodeficient)免疫缺陷小鼠时,都没有表现出明显临床病症,因此使用EV71 MA鼠适应株进行抑制剂抗病毒作用的评价。EV71 MA感染乳鼠后引发的主要症状是四肢麻痹,症状严重时可致死。骨骼肌组织是EV71 MA感染后主要富集的区域。通过在乳鼠体内连续传代的方式增强该病毒株的毒力后,采用7日龄昆明乳鼠作为EV71 MA攻毒动物模型。EV71 MA以106 pfu/只的剂量颅内感染昆明乳鼠后,使用筛选出的抑制剂以1mg/kg的剂量每天进行肌肉注射。生存曲线的结果表明所有药物组中只有PD169316治疗的乳鼠存活率要高于DMSO(二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide)对照组。PD169316治疗组乳鼠的存活率达到70%,而DMSO对照组的存活率仅有40%。PD169316组的乳鼠其死亡时间明显晚于对照。临床评分结果显示,对照组的乳鼠在感染后第5天普遍出现单肢麻痹的轻微病症,感染后第9天达到发病高峰,主要表现为四肢麻痹和死亡;而PD169316治疗组的乳鼠在感染后第9天普遍出现双肢麻痹症状。感染后11天,PD169316治疗乳鼠的病症有所恢复,评分结果显著优于DMSO对照组。除了生存曲线和临床评分的表现外,还在其他方面评价了PD169316的体内抗病毒效果。通过检测组织中的病毒RNA水平、病毒滴度及病毒抗原水平,结果显示PD169316显著降低了EV71在乳鼠骨骼肌中的复制水平。通过HE(苏木精-伊红,Hematoxylin and Eosin)染色对组织病理情况进行检查,结果表明,DMSO组乳鼠的脑部存在片状出血的现象,PD169316组乳鼠脑部则没有病理改变。DMSO组乳鼠肠组织中有明显的粘膜下炎性细胞浸润表现,而PD169316组则没有观察到明显的炎性细胞浸润表现。DMSO组乳鼠骨骼肌组织中可以观察到明显变性、水肿、出血及炎性细胞浸润,部分区域可见坏死改变,且病变分布弥漫,而PD169316组中炎性浸润和坏死症状都得到了有效的缓解。使用流式细胞术检测乳鼠血清中炎症因子的变化情况,结果显示,EV71感染后第5天,PD169316组乳鼠血清中TNF-α(肿瘤坏死因子α,tumor necrosis factor-α)和MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1,monocyte chemotactic protein 1)的水平显著低于DMSO对照组。综上所述,PD169316能够有效地抑制EV71在乳鼠体内的复制,降低炎症因子的分泌水平。通过进一步探索PD169316的抗病毒机制,发现EV71的复制是p38分子激活所必须的。EV71的单个蛋白,包括4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)不能激活p38分子。β-丙内酯灭活处理的EV71也不能激活p38-MAPK。同时,病毒复制是EV71诱导的caspase-3细胞凋亡所必须的。而流式细胞术和Western blotting检测结果均表明,PD169316可显著抑制EV71诱导的细胞凋亡,且该抑制作用具有明显的剂量依赖效应,乳鼠骨骼肌的免疫组化实验也获得了相似的结论。STAT1(signal transducers and activators of transcription 1,信号转导及转录激活因子1)的磷酸化是细胞凋亡中的重要环节,PD169316可抑制STAT1Ser727磷酸化和后续的细胞凋亡。使用si RNA敲低STAT1蛋白表达,进而降低STAT1Ser727磷酸化水平后,发现caspase-3、caspase-8和caspase-9的剪切水平都明显下调。这些结果说明p38/p-STAT1Ser727信号通路参与了对EV71诱导的宿主细胞凋亡的调控工作。为了说明PD169316是否通过降低细胞凋亡水平来抑制EV71复制,使用caspase-3特异性的抑制剂DEVD-CHO对caspase-3蛋白的激活进行抑制。结果显示,当细胞凋亡被抑制后,EV71的复制水平并没有下调。这说明PD169316的抗病毒作用不依赖于caspase-3介导的细胞凋亡。综上所述,本研究筛选到的p38 MAPK抑制剂PD169316具有显著的抗EV71病毒活性,并在细胞水平和乳鼠模型中验证了其抗病毒效果。EV71复制过程激活p38-MAPK信号通路,诱导宿主细胞凋亡的发生,p38/STAT1Ser727信号通路可能参与调控该过程。Caspase-3介导的细胞凋亡受抑制不影响EV71的复制。本工作为EV71治疗药物的研发提供了一种新选择。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373.2

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