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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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贝氏柯克斯体表面蛋白和T细胞表位的鉴定及免疫原性研究

焦俊  
【摘要】:贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)是一种革兰阴性、专性胞内寄生小球杆菌,为重要的人兽共患病——Q热(Q fever)的病原菌。贝氏柯克斯体感染人,可引起急性Q热和慢性Q热,贝氏柯克斯体感染家畜,主要引起牛、羊孕畜流产,而感染家畜也为人群Q热最主要的传染源。急性Q热用抗生素治疗有效,但未及时治疗而发展为慢性Q热后则难以治愈。疫苗接种是预防人、畜贝氏柯克斯体感染的最有效措施。虽然接种灭活贝氏柯克斯体全菌疫苗能够诱导机体有效对抗贝氏柯克斯体感染,但免疫后引起机体严重副反应使得其难以在人群中推广使用。目前,国内外学者力图采用先进的分子生物学技术对贝氏柯克斯体抗原分子进行研究,以期发现保护性抗原分子去研发安全有效的Q热分子疫苗。近十多年来,Q热分子疫苗的研究仅仅局限于少数几种贝氏柯克斯体外膜蛋白,研究证明它们的特异性保护效果有限且明显弱于灭活贝氏柯克斯体全菌抗原。我们采用生物素-链亲和素亲和层析从贝氏柯克斯体菌体裂解液中提取表面蛋白,采用等电聚焦和SDS-PAGE电泳分离提取的表面蛋白,采用电喷雾串联质谱鉴定分离的表面蛋白,结果发现37种贝氏柯克斯体表面蛋白。生物信息学将37种表面蛋白分为11个功能类型;8种蛋白具有经典的N端信号肽或非经典的分泌信号,提示可能为分泌蛋白;10种蛋白可能定位于细胞外膜,4种蛋白可能定位于非细胞质(包括外膜、内膜、周质),6种蛋白亚细胞定位未知。采用基因克隆技术成功在大肠埃希菌表达30个贝氏柯克斯体重组表面蛋白,再用镍离子亲和层析从表达菌中分离纯化重组表面蛋白,并将其点制一张贝氏柯克斯体表面蛋白芯片。用贝氏柯克斯体感染小鼠血清和Q热患者血清分析表面蛋白芯片,结果有23个表面蛋白与半数以上的贝氏柯克斯体感染小鼠4周血清反应阳性,其中15个表面蛋白与半数以上的Q热患者血清反应阳性并且具有较好的血清学特异性。该结果提示这15个主要血清反应表面蛋白可以作为Q热血清学检测的候选诊断抗原和研发Q热亚单位疫苗的候选免疫原。通过T细胞表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体7个表面蛋白的H2-Ab限制型CD4~+T细胞表位,预测出121条15氨基酸长的CD4~+T细胞表位肽,并人工合成这些表位肽。将这7个重组表面蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,再从免疫小鼠脾脏中分离CD4~+T细胞,然后将121条CD4~+T细胞表位肽分别与相应重组表面蛋白免疫小鼠CD4~+T细胞共孵育,最后用酶联斑点(ELISPOT)法分析每条表位肽诱导CD4~+T细胞的IFN-γ分泌水平。结果发现其中34条表位肽能够诱导CD4~+T细胞分泌较高水平的IFN-γ。剔除氨基酸序列高度相似的表位肽,最后选择其中22条为有效贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽。将这22条CD4~+T细胞表位肽分别体外刺激贝氏柯克斯体全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T细胞,最后选出源自7个不同蛋白抗原、可诱导CD4~+T细胞分泌高水平IFN-γ的7条CD4~+T细胞表位肽。将这7条CD4~+T细胞表位肽单独或混合刺激贝氏柯克斯体全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T细胞,用流式细胞术分析CD4~+T细胞的IFN-γ和TNF-α表达,结果发现它们都能诱导较高比例CD4~+T细胞表达IFN-γ,其中3条表位肽也能诱导较高比例CD4~+T细胞表达TNF-α。此外,ELISPOT法分析发现这7条表位肽混合诱导CD4~+T细胞分泌IFN-γ的水平显著高于单条表位肽,提示多条CD4~+T细胞表位肽混合激活CD4~+T细胞的效能显著好于单条表位肽。将这7条CD4~+T细胞表位肽单独或混合免疫C57BL/6小鼠,免疫后用贝氏柯克斯体攻毒评价其免疫保护效能。结果多条CD4~+T细胞表位肽混合免疫小鼠的脾重和贝氏柯克斯体载量均显著低于单条表位肽免疫小鼠,证明多条CD4~+T细胞表位肽混合免疫保护效果显著好于单条表位肽。通过T表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体的24个分泌蛋白和6个外膜蛋白的CD8~+T细胞表位,预测出157条H2-Kb、Db限制型9氨基酸长的CD8~+T细胞表位,并人工合成这些表位肽。将这157条CD8~+T细胞表位肽体外分别刺激贝氏柯克斯体感染C57BL/6小鼠的脾脏CD8~+T细胞,用ELISPOT分析每条表位肽诱导CD8~+T细胞的IFN-γ分泌水平。结果显示29条表位肽均能诱导CD8~+T细胞分泌较高水平IFN-γ。其中22条表位肽的源蛋白为分泌蛋白,它们并非主要血清反应蛋白。将这29条CD8~+T细胞表位肽分别刺激贝氏柯克斯体感染C57BL/6小鼠的CD8~+T细胞,流式细胞术分析显示所有表位肽均能单独诱导CD8~+T细胞表达IFN-γ,表达IFN-γ的CD8~+T细胞比例为0.44%~3.78%。将29条CD8~+T细胞表位肽基因串联后连接至原核表达质粒,将重组表达质粒电转入单核细胞增生性李斯特杆菌疫苗菌(LM),构建表达贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽的疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠,免疫后用贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠评价其免疫保护效能。结果LM-Cb免疫小鼠的脾重和贝氏柯克斯体载量均显著地低于空质粒转化菌免疫小鼠或非免疫小鼠,证明贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽在LM-Cb中表达并诱导机体产生有效抗贝氏柯克斯体感染特异性免疫。综上所述,我们分离、鉴定了37个贝氏柯克斯体表面蛋白,制备了30个贝氏柯克斯体重组表面蛋白并用其构建贝氏柯克斯体表面蛋白芯片。用贝氏柯克斯体感染血清分析表面蛋白芯片,发现15个血清学反应阳性且有良好血清学特异性的表面蛋白。计算机软件分析贝氏柯克斯体外膜蛋白和分泌蛋白的氨基酸序列,预测并人工合成121条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽和157条CD8~+T细胞表位肽,筛选出能够激活相应T细胞的CD4~+T细胞表位肽7条和CD8~+T细胞表位肽29条。研究进一步证明7条CD4~+T细胞表位肽混合激活CD4~+T细胞和29条CD8~+T细胞表位肽混合激活CD8~+T细胞的能力均显著高于单条表位肽。将7条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽单独或混合免疫小鼠,再用贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠评价免疫保护效能,结果7条CD4~+T细胞表位肽混合免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显著低于单条表位肽免疫小鼠。将29条贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽基因串联后插入原核表达质粒,将重组表达质粒转化李斯特菌免疫小鼠,结果表达CD8~+T细胞表位肽的疫苗菌免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显著低于空质粒转化菌免疫。这些结果证明多条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽或CD8~+T细胞表位肽联合免疫能够显著增强机体特异性免疫应答、有效对抗贝氏柯克斯体感染。我们的研究结果为Q热血清学诊断试剂和Q热分子疫苗的研制奠定了良好的理论与工作基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R392

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