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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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小鼠造血干细胞发育的功能异质性研究

叶辉  
【摘要】:造血干祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)能够每秒再生数以百万的血细胞,这一过程伴随我们生命的始终。虽然造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)也能够产生造血细胞,但是它不具备严格的自我更新的能力。作为整个造血系统的顶层设计者,只有造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有自我更新以及多向分化的能力。上世纪50年代,越来越多的研究者开始发掘HSC的表面标志并且以多种标志组合富集这一群体,着力通过体内及体外的系统实验将HSC的起源、发育分化、调控机制等问题研究清楚。在各种HSC标志组合提高了其富集效率的同时,HSC的异质性特点也被发现。简单地说,人们通过各种标志组合富集的HSC,也许不能反映HSC的全貌,结果只是其中的代表性HSC或者是一部分HSC亚型。那么,这使人们针对HSC的起源、发育分化、调控机制的研究更加模糊。所以,HSC的异质性问题迫切需要解决,才能将HSC的发育与再生研究透彻。此前,国外的研究者发现了小鼠发育过程中胚胎第14.5天(embryonic day 14.5,E14.5)的胎肝阶段至成体骨髓阶段的HSC多种亚型,通过体内功能实验,重点描述了E14.5胎肝阶段及3周以后的骨髓阶段的HSC异质性亚型发育动力学及生理学特点。实际上,在胎肝最早发现的HSC主要由产生于其它生血位点的成熟HSC随血液循环迁移而来。基于内皮造血转化(endothelial to hematopoietic cell transition,EHT)的生血假说,即内皮细胞是造血细胞的起源,在HSC成熟之前,不成熟的HSC也被称之为造血干细胞前体(pre-hematopoietic stem cell,pre-HSC),分为pre-HSCⅠ类(Type 1)与pre-HSCⅡ类(Type 2)。那么,在小鼠胚胎发育早期最重要的生血位点——主动脉-性腺-中肾区(aortagonad-mesonephros,AGM),不成熟的pre-HSC及已经成熟的HSC是否会包含两种及以上的功能HSC亚型呢?是否在刚刚产生pre-HSC时就已经决定了其异质性亚型?pre-HSC和HSC的各种亚型的生物学特点又是什么?这些问题都还未得到明确的答案。首先,我们通过E11 AGM区新鲜细胞的极限稀释(limit dilution assay,LDA)的直接移植,得到单克隆水平的重建受体后,收集成功重建受体的外周血,对使其重建的HSC进行了追溯性分析。在得到的40个单克隆的HSC直接移植后长期重建的受体中,85%(34/40)的HSC表现为髓系相对缺陷分化的特性(γ-HSC),另外有15%(6/40)则为淋系髓系平衡型的HSC(β-HSC),未发现淋系相对缺陷型HSC(α-HSC)及髓系绝对缺陷型HSC(δ-HSC)。另外,在34个γ-HSC中,根据其发育动力学特性,新发现了少部分的在髓系分化缺陷基础上的合并T淋巴细胞分化相对缺陷的γ-HSC(B-dominantγ-HSC),剩下的大部分被定义为平衡型的γ-HSC(balancedγ-HSC)。通过与国际上报道的胎肝及成体骨髓阶段HSC亚型的对比,可以发现胚胎早期AGM区的HSC亚型构成比例有很大不同,各个亚型的特点也不尽相同。其次,通过OP9-DL1共孵育后移植系统,获得单个pre-HSC孵育后移植重建成功的受体,同样追溯性地发现了pre-HSC的亚型及特点。在得到的单个pre-HSC成功重建的22个受体中,55%(12/22)展示为髓系相对缺陷分化特性的pre-HSC(γ-pre-HSC),其余45%(10/22)为淋系髓系平衡型pre-HSC(β-pre-HSC)。同样地,我们并未发现淋系相对缺陷型的α-pre-HSC及髓系绝对缺陷型的δ-pre-HSC。而且,在γ-pre-HSC中也出现了类似HSC亚型分布的B-dominantγ-pre-HSC亚型,并未发现pre-HSC发育阶段的类型与pre-HSC亚型有对应关系,即pre-HSC Type1与pre-HSC Type2在pre-HSC亚型分布上类似。至此,我们在单克隆和单细胞水平发现了最重要的发育位点AGM区的HSC及pre-HSC亚型构成及特点,完善了小鼠胚胎发育时间轴上的异质性问题。在此基础上,我们应用单细胞测序技术发现:相对于成体阶段(8-12周的骨髓),胚胎阶段(E11 Type 1、E11 Type 2、E14胎肝)高表达多个谱系分化相关的基因,提示胚胎阶段可能是调控HSC多向分化或者决定成为不同亚型的关键时期。最后,我们应用Sm22a-cre、ROSATMT、ROSAEYFP工具小鼠,在HSC发生的重要时间窗及位点,以Sm22a-cre标记的间质细胞可能构成HSC发生的微环境为结合点,研究HSC异质性亚型的发生机制。Sm22a虽然是平滑肌的标志,但Sm22acre在E10.5至E11.5 AGM区及胎肝阶段HSPC中均有表达,在内皮造血转化过程中的Tpye1 pre-HSC阶段,也有类似于成体骨髓中CD45+细胞的表达比例(30%左右)。然而,在分选得到的Sm22a-cre来源的内皮细胞、间质细胞群体与OP9-DL1共孵育后,虽然产生了较丰富的造血细胞簇,但移植后却不能成功重建受体。而且,我们分选得到的Sm22a-cre来源的间质细胞(代表AGM区腹侧微环境细胞群体),与非Sm22a-cre来源的间质细胞(代表AGM区背侧微环境细胞群体),进行了实时荧光定量PCR分析,发现前者的Bmp4表达量低。最后,我们应用HSC群体细胞移植,区分Sm22a-cre来源的骨髓HSC,在得到的成功重建受体中,未发现以Sm22a-cre区分的截然不同的HSC亚群特性,因此确定不能单纯通过Sm22a-cre来源在骨髓HSC中的表达发现不同的HSC的亚型。综上,本研究首次发现了在小鼠胚胎发育早期重要的造血发育位点AGM区,在内皮造血转化发生的时间窗内,有两种主要的HSC亚型,主要以髓系相对缺陷型的HSC为主,并且通过pre-HSC发育成熟而来,推测HSC异质性亚型在preHSC阶段就已经被决定了。另外HSC与pre-HSC均未发现淋系相对缺陷型及髓系绝对缺陷型的亚型。通过后续应用Sm22a-cre在造血发生微环境的表达,发掘E10.5-E11.5 AGM区HSC亚型发生的机制问题,无论从造血发生的空间异质性(Sm22acre来源的内皮细胞和间质细胞代表的造血发生微环境),以及时间异质性(来源于Sm22a-cre的不同发育时间及位点的表达),我们并未得到满意的答案。重要的是,通过pre-HSC的单细胞测序的数据发现胚胎阶段相比成体阶段,对于HSC异质性亚型的调控可能更为关键。我们期待未来通过更深入的研究,应用HSC表面标志将不同亚型的HSC区分,这可能将α-HSC在胎肝阶段的起源问题及pre-HSC/HSC出现的不同亚型的调控机制研究清楚。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R329.2

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