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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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PLAC8在EV71感染致病中的作用机制研究

杨晓霞  
【摘要】:肠道病毒71型(EV71)是婴幼儿重症手足口病的主要病原体之一,可导致脑干脑炎、肺水肿等组织病变,严重威胁婴幼儿的健康成长。EV71感染死亡病例的脑干、脊髓、肺间质中均可观察到中性粒细胞的浸润,说明EV71感染导致的组织炎症反应损伤在EV71感染致病中起重要作用。然而,EV71感染导致一系列炎性反应以及为什么只在婴幼儿阶段感染致病的分子机制尚不清楚。为了揭示EV71在婴儿体内感染致炎性病变的机制,本研究利用EV71感染小鼠脑组织基因芯片筛选可能在组织炎性损伤中发挥作用的靶标蛋白。首先我们通过腹腔注射EV71病毒到1日龄昆明乳鼠,建立EV71感染小鼠模型。分别在感染三天及六天时,采取感染组及对照组小鼠脑组织,提取RNA,进行Affymetrix基因芯片检测,筛选差异表达基因。通过KEGG聚类分析及差异基因功能分析发现,这些差异表达基因大都与抗病毒免疫相关。而其中,在感染三天及六天均上调表达的PLAC8基因目前的功能报道大都集中于促进细胞生长、癌症进程方面。然而在HBV感染清除以及感染导致系统性炎症患者体内均检测到了PLAC8基因的差异表达。以上报道及结果均表明,PLAC8很可能在抗病毒免疫中发挥了重要的作用。因此,本研究以PLAC8为对象,研究其在EV71感染中可能发挥的功能。EV71主要感染5岁以下的婴幼儿,而重病患者大都在三岁以下。用EV71分别感染1日龄、2日龄、3日龄昆明小鼠,发现1日龄小鼠感染后相继出现消瘦、四肢无力、瘫痪等明显病变,感染七天后全部死亡。2日龄小鼠较1日龄小鼠的病变率和死亡率显著降低,感染第七天死亡率为20%。而3日龄小鼠基本无明显病变及死亡。说明EV71在小鼠中的感染也与年龄相关,乳鼠更易感。因此,可以利用EV71感染小鼠模型研究EV71感染与年龄的关系。为了研究PLAC8是否与EV71感染的年龄依赖性相关,对不同年龄小鼠肺组织中PLAC8的mRNA和蛋白表达进行检测,发现PLAC8的mRNA和蛋白表达均随年龄增加而显著下调。同时我们收集了小于3岁年龄组、3-12岁年龄组和12-18岁年龄组健康人外周血,每组各12-20人,提取全血RNA后,Real-time检测外周血白细胞中PLAC8基因的mRNA表达。发现在人体中,PLAC8的表达量也随年龄增长而显著下调。说明PLAC8很有可能与EV71在婴幼儿中更易感相关。随后,在肺癌细胞A549中过表达PLAC8,发现PLAC8的过表达显著促进EV71的增殖。并且在感染早期,6小时的时候,PLAC8过表达细胞中可显著检测到EV71结构蛋白VP1的表达,而此时对照组细胞中检测不到VP1蛋白的表达。说明PLAC8在EV71感染的早期即可促进病毒的增殖。分析其可能的原因有:PLAC8促进病毒受体SCARB2或PSGL-1的表达,使进入细胞的病毒数增加;PLAC8调控EV71病毒5’UTR活性,促进病毒翻译;PLAC8抑制宿主细胞的抗病毒免疫,促进病毒增殖。因此,我们首先检测了PLAC8对EV71病毒受体SCARB2和PSGL-1表达的影响,发现PLAC8的过表达并未引起EV71受体表达量的增加。然后将病毒的5’UTR插入到荧光素酶基因的调控区,发现PLAC8未显著引起荧光素酶的表达,说明PLAC8并不是通过调控EV71病毒5’UTR的活性而促进病毒基因的复制和翻译。随后对dsRNA的模式识别受体TLR3进行检测,发现PLAC8的过表达显著抑制TLR3及其下游干扰素调控基因IRF3的表达。说明PLAC8在感染早期对病毒增殖的促进是因为PLAC8抑制了宿主的抗病毒免疫应答,为病毒的增殖提供了良好的宿主环境,从而加速病毒的增殖。由于EV71感染产生的病变主要是脑、肺等组织的炎性损伤,因此检测了PLAC8过表达对THP-1细胞产生炎症因子IL-6能力的影响。发现PLAC8可以显著促进IL-6的表达。由于辅助性T淋巴细胞(T helper cells)的分化平衡在婴幼儿免疫及抗病毒、炎性反应失衡中发挥了重要作用,因此我们通过浅表颞静脉注射PLAC8表达质粒,构建PLAC8过表达小鼠模型,探讨EV71感染后对Th细胞分化诱导因子表达的影响。发现在PLAC8过表达小鼠中,EV71感染后,与对照组相比,细胞因子IFN-γ的表达显著下调,IL-6、IL-4、IL-17A和TGF-β的表达显著上调。而IFN-γ是Th1细胞分化的诱导因子,IL-6和IL-17A是Th17细胞分化诱导因子,而IL-4和TGF-β分别是Th2和Treg细胞分化诱导因子。因此,PLAC8的过表达,抑制Th1细胞分化,抑制其介导的抗病毒细胞免疫;促进Th2、Th17和Treg细胞分化,从而促进其介导的炎症反应和免疫抑制作用。同时,PLAC8过表达小鼠外周血和肺组织中干扰素IFN-γ的下调和炎症因子IL-6的上调也证明了PLAC8的过表达抑制了抗病毒免疫应答并促进了炎症反应的增强。EV71感染PLAC8过表达小鼠后,对小鼠的脑、肺组织进行切片、HE染色观察病理变化。与对照小鼠相比,PLAC8过表达小鼠肺泡壁增厚、局部肺泡结构消失以及淋巴细胞浸润现象更明显;而脑组织神经元细胞数量减少、细胞核固缩的现象也更明显。证明过表达PLAC8后,EV71更易感染小鼠产生病变。综上所述,利用EV71感染小鼠脑组织基因芯片筛选出可能在抗病毒免疫中发挥作用的PLAC8蛋白。分子生物学实验表明,PLAC8通过抑制模式识别受体TLR3及其下游干扰素调控基因IRF3的表达,抑制抗病毒免疫应答,为病毒复制提供良好的宿主环境,从而促进病毒增殖。同时PLAC8可以促进炎症因子IL-6的表达。动物学实验表明,PLAC8调控Th细胞分化诱导因子的表达,抑制IFN-γ的表达,促进IL-6、IL-4、IL-17A和TGF-β的表达,使Th细胞分化由Th1向Th2、Th17和Treg偏移,导致细胞抗病毒免疫和炎症反应应答失衡。由于PLAC8的表达随年龄增长下调,即在乳鼠中高表达,所以更易感染EV71病毒产生炎性病变。以上研究结果为揭示EV71在婴幼儿中更易感致病的原因提供了重要线索。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R373

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