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《中国人民解放军军事医学科学院》 2017年
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活体成像监测纳米金激活肝脏SAA及SAA促进T细胞迁移作用研究

张玉龙  
【摘要】:背景:随着纳米科技的迅猛发展,纳米尺度材料在生物医药领域的应用越来越广泛,纳米颗粒对环境以及人类健康的影响逐渐引起人们关注。纳米材料的理化性质是决定其在生物体内命运的基础,如形貌、粒径、表面化学等,直接决定其与体内循环系统和吞噬性细胞作用的方式和代谢途径。肝脏是人体中重要的解毒器官,也是纳米材料在人体内的主要蓄积地点之一,因此,充分评估纳米颗粒暴露后以肝脏炎性反应为首的不良反应是至关重要的。然而,目前无论是临床还是实验室均缺乏明确的、具有高灵敏度和高认可度的生物学指标用于评估和指示纳米药物、纳米佐剂或纳米造影剂暴露后,肝脏炎症细胞、炎性介质以及所发生的急性免疫反应之间的复杂相互作用。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种非常灵敏的急性时相反应蛋白,肝脏是急性时相反应期间合成SAA的主要场所。已有研究尝试将SAA、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)联合触珠蛋白(haptoglobin,HP)作为生物标志物进行二氧化硅纳米材料暴露毒性的预测。那么,可否将SAA作为一种灵敏、可靠的生物学指标用来评估和筛选应用广泛的系列纳米金材料,并探究其引起的急性毒性与其粒径形貌之间的关联呢?SAA除了可能作为一种灵敏的纳米肝毒性生物标志物之外,也具有一定的免疫调节作用。已有报道表明,急性炎症期间,循环系统中升高的SAA作用于单核巨噬细胞,促进其分泌系列趋化因子,从而招募更多的白细胞到炎症部位。那么SAA在体内是否能够调控T细胞的迁移和归巢,增强CTL细胞的杀伤功能,并增强其抗肿瘤作用效果呢?为回答上述科学问题,我们开展本论文的研究工作。目的:针对SAA可能作为一种灵敏、可靠的纳米肝毒性生物学标志物及其在机体炎症免疫调节中的作用效果,本研究旨在探讨SAA是否能够作为评价纳米金暴露引起肝脏急性炎症反应的生物学指标,并阐明涉及其中的炎症级联反应和信号通路的相关机制;同时探索SAA对过继性T细胞在体内趋化及迁移归巢的调控作用,并阐明其相关机制。方法及结果:(1)SAA-Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型的建立及验证。应用水动力高压转染技术结合密码子优化的噬菌体整合酶体系,将SAA和STAT3的报告基因质粒转染到小鼠肝脏,并且整合到小鼠染色体中,通过活体荧光成像系统,实现对上述功能蛋白的实时、动态、无创监测。结果发现,在相同刺激水平的情况下,通过小鼠模型得到的结果与采用传统蛋白检测方法得到的结果基本吻合。同时,由于引入了噬菌体整合酶体系,能够实现报告基因在肝实质细胞中的长时间稳定表达,建模90天后的SAA-Luc小鼠模型依然能够对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)产生强烈且迅速的响应。说明肝脏SAA及STAT3可视化小鼠模型构建成功,并且上述小鼠模型尤其适合于对肝脏功能蛋白进行长期的动态监测。(2)纳米金因形貌和粒径的不同激活的肝脏SAA表达有明显差异。采用可视化SAA-Luc小鼠模型评价了6种不同形貌和粒径纳米金的肝脏急性炎症反应,其激活肝脏SAA表达的强弱顺序为:GNS50GNS30GNS10GNCsGNRsGNS80,其中处于临界尺度的粒径约50nm的球形纳米金相比其他尺寸及形貌材料能够引起更强的肝脏急性炎症反应。上述结果同时说明,在相同表面修饰情况下,肝区细胞摄取纳米材料的途径和引起肝脏炎症反应的程度由纳米粒子的几何形状、尺度及其在生物体内的分布共同决定。在所考察的尺度范围内,球型纳米金引起肝脏急性炎症的强弱具有尺度依赖性,但是该影响非线性相关。(3)SAA-Luc小鼠模型对纳米金刺激的响应更灵敏。在0.02、0.1、0.5和2.5 mg/kg的GNS50暴露剂量下分别使用SAA-Luc小鼠模型和ELISA检测SAA的表达量。结果表明,0.1mg/kg的GNS50暴露后应用小鼠模型能够监测到SAA的表达,其峰值荧光强度为基础值的5倍左右,而此时ELISA已经检测不到血清中SAA浓度的变化。同时发现在2.5 mg/kg的GNS50暴露下应用SAA-Luc小鼠模型检测到的SAA表达峰值时间早于通过ELISA得到的结果(4h vs.12h)。上述结果说明基于活体荧光成像技术的SAA-Luc小鼠模型相较于ELISA等血清学检测方法不仅更灵敏,而且可以实现对纳米暴露的早期预警。(4)纳米金暴露后诱导肝脏Kupffer细胞M1极化,分泌系列促炎因子,启动SAA表达。ELISA检测了GNS50暴露后2h内肝脏研磨液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。结果表明,这些促炎因子在纳米金暴露后1h即明显升高。随后使用SAA-Luc小鼠模型动态评价了GNS50暴露后1h到2h之间SAA的激活,发现从80min后开始能够监测到小鼠肝脏SAA的表达,晚于肝脏促炎因子升高的时间。分别注射IL-1β、IL-6或TNF-α到小鼠体内均能明显激活SAA表达。为探究这些细胞因子的来源,我们检测了纳米金暴露后肝脏Kupffer细胞和骨髓来源巨噬细胞表型的变化。结果表明,纳米金能够诱导肝脏Kupffer细胞M1极化,极化后的巨噬细胞能够分泌大量IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子。将肝脏Kupffer细胞去除以检测Kupffer是否是SAA激活早期肝脏中促炎因子的主要来源。结果表明,受Kupffer细胞去除的影响,肝脏促炎因子早期分泌受到明显抑制,肝脏SAA的表达明显滞后。上述结果表明纳米金暴露后随血液循环系统进入肝区,首先与肝脏Kupffer细胞相互作用,诱导其发生M1极化,分泌系列促炎因子,启动SAA表达。(5)纳米金通过NF-κB信号通路激活肝脏SAA表达。通过NF-κB-Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型,结合EMSA和Western Blot等方法,证明了GNS50能够激活肝脏NF-κB和STAT3信号通路。使用NF-κB抑制剂PDTC能够明显抑制SAA的表达,但是在使用STAT3信号通路的抑制剂ASD1480和Cryptotanshinone后SAA的表达却没有受到明显的抑制。这些结果说明纳米金诱导的肝脏SAA表达经由NF-κB信号通路。(6)SAA调控过继性T细胞的迁移和归巢。SAA瘤内注射后,能够明显提高过继性CD8+T细胞对肿瘤生长的抑制作用。进一步的机制研究结果表明,SAA能够诱导肿瘤相关巨噬细胞发生M1再极化,分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子以及CCL3、CCL5和CXCL9等趋化因子,逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态,促进过继性CD8+T细胞向肿瘤部位趋化,从而增强其对肿瘤生长的抑制作用。结论:通过水动力高压转染结合密码子优化的噬菌体整合酶系统构建成了SAA-Luc和STAT3-Luc小鼠模型,能够实时、动态、并且长期对同一队列小鼠SAA的表达分泌和STAT3信号通路的激活进行监测。使用上述小鼠模型评价了纳米金暴露引起的肝脏炎症反应,阐明了其中的信号通路机制,为纳米材料作为药物载体、光热治疗试剂或疫苗佐剂等在生物医药领域中的应用评估提供了灵敏、可靠的动物模型体系。同时发现SAA能够调控过继性T细胞的迁移和归巢,逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态,从而提高其抑制肿瘤生长的能力。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R363

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