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SEN病毒分子病毒学和流行病学研究

杜娟  
【摘要】: 近年来,随着5种肝炎病毒(A-E)的发现,有80%-90%的病毒性肝炎病例得到了很好的解释,在剩下的10%-20%的病例中,病人虽然有典型的病毒性肝炎的症状,却检测不到已知的五种肝炎病毒的血清学标志物。而1989年HCV和1990年HEV的发现使我们坚信所有病毒性肝炎都应该是由相应的病原体引起的,因此人们一直在努力寻找隐藏在这些原因不明的病毒性肝炎背后的病原体。1999年6月,Diasorin Research Centre的Panielli Primi领导的研究小组研究人员在一个首写名为SEN的HIV静脉吸毒者患者血液中发现了一种新的DNA病毒,将其称作SEN病毒。目前对SEN病毒的研究才刚刚起步,对它的认识还很不全面,对其致病性也未有系统深入的研究。本研究的目的在于对SEN病毒中怀疑与不明原因输血后肝炎有关的两个亚型SENV-D和SENV-H的分子生物学特性以及它们在中国各类人群中的流行情况进行初步研究,并希望从中得到确定SEN病毒致病性的有用信息。 1.SEN病毒D和H亚型中国分离株的克隆及序列分析 我们在前期工作的基础上,结合已发表的文章及基因序列,针对SENV-D和SENV-H基因组设计特异性引物,利用套式PCR技术从两例non-A-E肝炎患者血清中分段克隆得到了一个SENV-D亚型分离株(SENV-D-BJ1)的全部编码区基因序列,还得到了一个SENV-D亚型分离株(SENV-D-BJ2)的大部分编码区基因序列(包括ORF1和ORF2);从一例健康人血清中分段克隆得到了两个SENV-H亚型分离株(SENV-H12-1和SENV-H12-2)的全部编码区基因序列。分析其基因组结构及基因排列情况,两个SENV-D亚型分离株与已发表的对SENV-D(AX025730)株分析的结果相吻合。两个SENV-H亚型分离株的情况与已发表的 博士学位论文:SEN病毒分子病毒学和流行病学研究 对SEN琴H(AX025838)株分析的结果有所不同:SENV-H12一1分离株的ORFI 仅由675个氨基酸组成,比SENV-H(AXO25838)的ORFI少N一末端的92个氨 基酸,此外在2个位点上还存在插入:SENV-H12一2分离株在一些位点上的缺失造 成O盯1蛋白比SENV-H(AXO25838)少7个氨基酸,由于第一个起始密码子发 生突变,采用位于下游的第二个起始密码子使得O即2蛋白比SENv--H (AXO25838)少N一末端的7个氨基酸。所有这四个中国分离株,均保留了O即1 中与复制有关的保守序列(FTL和YXXK):在推测是非结构蛋白的ORFZ中均含 有CAV样保守区W‘X7一H一X3一C一Xl一C一XS一H;ORF3蛋白的碱性氨基酸(精氨酸和 赖氨酸)簇后紧接着一个富含丝氨酸的区域,与D.molanogaster的DNA拓扑异构 酶I有一定的同源性,推测在单链DNA的复制中起作用。 2.聚合酶链反应检测SEN病毒D和H亚型方法的建立及我国SEN病毒D和H 亚型流行情况的初步调查 为了了解人群中SENV-D/H的流行情况,我们参考己发表的文章及基因序列, 设计引物,分别针对SEN丫D亚型和SENV-H亚型建立了两套套式聚合酶链反应 (nPCR)检测方法,并对这两种套式PCR方法的检出率和特异性做了比较,确定 了创门的灵敏度均为每反应体系10Ocopies;为了调查sEN病毒在我国的流行情况, 我们对收集的健康献血者和各型肝炎患者(包括甲肝、乙肝、丙肝和非甲非戊型 肝炎患者)的血清标本进行PCR检测。对数据做统计学分析后发现:在我国献血 者中SENV-D和SENV-H亚型感染率相当(26%vs 24%),SENV-D/H(s ENV-D 和/或SEN从H)的感染率为31%,显著高于美国、意大利以及泰国报道的2%一5% 的比例;与日本、台湾和德国的报道的巧%一20%感染率相当。SENV-D/H在HBV 和HCV患者中的合并感染率比在健康献血者以及甲肝患者中的感染率有显著上升 (59%一85%vS31%一36%,P0.05),这一结果与日本和台湾的报道相吻合。此外我 们的调查发现SENV-D旧在non一A一E肝炎患者中的感染率也显著高于献血者和甲 肝患者(68%vs 31一36%,P0.01),而与其它肝炎患者中的感染率相当。 3.SENV-D和SENV-H分离株进化地位分析 本文中对分离得到SENV-D和H亚型中国株(SEN从D一BJI和 SENV-D一BJZ 以及SEN琴H12一1和SENV-H12一2)做的全序列系统发育分析显示,它们的确归 属于SEN琴D和H亚型,并且发现SENV-H亚型内不同分离株之间的差异比 SENV-D分离株之间的差异大的多(0.030一0.236 vs 0.026一0.119)。对SENV-D和H 3 博士学位论文:SEN病毒分子病毒学和流行病学研究 亚型在nonA一E肝炎患者和无偿献血者中的进化趋势作了比较,发现两者在进化地 位上无显著的差别。对SENV-D和H亚型来自不同地域的分离株进行了系统发育 分析,发现来自不同地区的SENV并未按照地域分布聚集成簇。这一现象在TTV 和TLMV中也存在,说明人体内的圆环病毒在很久之前就己存在了。 4.SENV-D株ORFs的表达、鉴定 通过构建不同的表达载体,实现了SENV-D亚型O盯2、ORF3和ORFIC- 末端蛋白(ORFI一P2)的体外表达。通过免疫印迹方法检测了O盯1一PZ蛋白和0盯3 蛋白的抗原性,发现ORFI一PZ蛋白和ORF3蛋白分别与5份PCR阳性血清中的1 和2份产生了可见的抗原抗体反应,而与3份PCR阴性血清均无反应。 以上仅从分子病毒学和


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