应用膜芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

【摘要】： 目的 了解结核分枝杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况，研究rpoB基因突变与RFP最小抑菌浓度(MICs)之间的关系；研制一种新型的DNA芯片，用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。 方法 临床标本进行传统分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验；对耐药结核分枝杆菌分离株进行RFP MICs测定，RFP浓度如下：0、25、50、100、150、200、250ug／ml；通过16S rDNA PCR-SSCP分析方法对138株临床分离株进行分枝杆菌初步分子菌种鉴定；通过PCR-SSCP、膜芯片和PCR-直接测序(DS)技术分析结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因。 结果 138株分枝杆菌临床分离株经PCR-SSCP初步分子菌种鉴定，5株为非结核分枝杆菌，133株为结核分枝杆菌复合群。对133株结核分枝杆菌进行了传统药物敏感性试验，52株为RFP敏感株，81株为耐RFP菌株。 用引物rpob3和rpob4扩增81株结核分枝杆菌耐RFP分离株和52株RFP敏感株，均产生240bp片段。通过PCR-SSCP方法分析133株结核分枝杆菌分离株rpoB基因240bp片段，发现52株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同；81株耐RFP菌株中，76株(93.8％)SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同，其余5株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。 通过膜芯片的方法分析133株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因，发现52株敏感株膜芯片杂交结果与标准株完全相同；81株耐RFP临床分离株中有75株检测到rpoB基因突变，检出率为92.6％；其中531位密码子突变46株，占56.8％(46／81)；526位密码子突变15株，占18.5％(15／81)；其它密码子突变14株，占16.7％(14／81)。选择1株RFP敏感株和25株耐RFP分离株进行PCR-直接测序(Ds)分析，其中25株分离株测序结果与膜芯片检测结果一致，1株耐RFP分离株测序结果为517、518为密码子联合突变，而膜芯片检测结果为阴性。 对54株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP MICs测定，结果：5株MICs为0 ug／ml，2株MICs为25ug／ml，2株MICs为50ug／ml，3株MICs为100ug／ml，6株MICs为150ug／ml，8株MICs为200ug／ml，28株MICs为250ug／ml。7株MICs＜ 50ug加班的菌株都没有发生rpoB基因突变，47株RFP MICsg50ug颅l的菌株中有 43株发生rPOB基因突变。 结论 用膜芯片可简便／快速、灵敏、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利 福平分离株的rpoB基因突变，可用于临床耐药性的检测。