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应用膜芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

曹立雪  
【摘要】: 目的 了解结核分枝杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况,研究rpoB基因突变与RFP最小抑菌浓度(MICs)之间的关系;研制一种新型的DNA芯片,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。 方法 临床标本进行传统分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验;对耐药结核分枝杆菌分离株进行RFP MICs测定,RFP浓度如下:0、25、50、100、150、200、250ug/ml;通过16S rDNA PCR-SSCP分析方法对138株临床分离株进行分枝杆菌初步分子菌种鉴定;通过PCR-SSCP、膜芯片和PCR-直接测序(DS)技术分析结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因。 结果 138株分枝杆菌临床分离株经PCR-SSCP初步分子菌种鉴定,5株为非结核分枝杆菌,133株为结核分枝杆菌复合群。对133株结核分枝杆菌进行了传统药物敏感性试验,52株为RFP敏感株,81株为耐RFP菌株。 用引物rpob3和rpob4扩增81株结核分枝杆菌耐RFP分离株和52株RFP敏感株,均产生240bp片段。通过PCR-SSCP方法分析133株结核分枝杆菌分离株rpoB基因240bp片段,发现52株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同;81株耐RFP菌株中,76株(93.8%)SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同,其余5株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。 通过膜芯片的方法分析133株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因,发现52株敏感株膜芯片杂交结果与标准株完全相同;81株耐RFP临床分离株中有75株检测到rpoB基因突变,检出率为92.6%;其中531位密码子突变46株,占56.8%(46/81);526位密码子突变15株,占18.5%(15/81);其它密码子突变14株,占16.7%(14/81)。选择1株RFP敏感株和25株耐RFP分离株进行PCR-直接测序(Ds)分析,其中25株分离株测序结果与膜芯片检测结果一致,1株耐RFP分离株测序结果为517、518为密码子联合突变,而膜芯片检测结果为阴性。 对54株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP MICs测定,结果:5株MICs为0 ug/ml,2株MICs为25ug/ml,2株MICs为50ug/ml,3株MICs为100ug/ml,6株MICs为150ug/ml,8株MICs为200ug/ml,28株MICs为250ug/ml。7株MICs< 50ug加班的菌株都没有发生rpoB基因突变,47株RFP MICsg50ug颅l的菌株中有 43株发生rPOB基因突变。 结论 用膜芯片可简便/快速、灵敏、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利 福平分离株的rpoB基因突变,可用于临床耐药性的检测。


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