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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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白纹伊蚊对溴氰菊酯抗药性相关基因的研究

吴家红  
【摘要】:病媒昆虫对杀虫剂的抗药性问题已严重制约了杀虫剂的持续有效使用。为了控制抗药性种群的扩散和发展,迫切需要对杀虫剂抗药性的发生和发展问题有一个深入研究。白纹伊蚊作为重要的媒介蚊虫,当前的研究主要集中在抗药性的产生、遗传方式、生化水平等方面,从分子水平探讨其抗药性机理的相关报道还不多见。本研究以实验室筛选的对溴氰菊酯高抗的一株白纹伊蚊(R-lab株)为研究对象,采用生化和分子生物学方法从代谢酶活性,击倒抗性及其它可能与抗药性相关的基因等多个角度对R-lab株可能的抗药性机理进行了探讨。获得了以下的结果: 1.R-lab株抗药性生物测定和生化检测的研究 活体增效实验和离体解毒酶实验结果表明PBO增效作用显著,增效倍数为120倍,GST酶活性上升1.29倍,EST酶活性没有改变。这些结果提示代谢抗性机理是R-lab株抗药性机理的主要原因之一,而其中细胞色素单加氧酶活性升高在R-lab株的抗药性形成中占有主要作用,GST酶活性升高与R-lab抗药性形成相关,EST酶对R-lab株抗药性形成作用较小。 2.击倒抗性在R-lab株中的作用 2.1 白纹伊蚊钠通道基因序列分析 采用RT—PCR方法和RACE方法首次获得了白纹伊蚊钠通道基因近全长序列6304bp,序列分析表明除去3端非编码区外,共编码2058个氨基酸,包括四个结构域及连接它们的亲水肽段以及目前已报导有抗性相关突变的所有区域,足以用于击倒抗性的研究。同源性分析表明由该序列推定的氨基酸序列与果蝇para氨基酸序列相似性最高(83.1%),与鼠钠通道(RatⅠ)的相似性达42.6%,说明克隆得到的是与果蝇para基因同源的白纹伊蚊para-like基因。 2.2 抗性白纹伊蚊钠通道基因cDNA序列分析 对R—lab株中抗性个体钠通道基因IIS4—IIS6节段及近全长基因的序列分析均未发现与抗性相关突变。这一系列研究至少可以说明击倒抗性在R—lab株中 白纹伊蚊对澳氰菊酷抗药性相关基因的研究 中文摘要 的作用较小。 2.3白纹伊蚊钠通道基因可变剪接及可能的生物学意义 在高抗个体钠通道基因近全长序列分析中,发现了8个可变剪接子,它们分 别是exona,exoni,exonb,exone,exonf,exonh,exonm和exonn。 其中exonm和exonn在昆虫是首次发现。这些结果表明可变剪接广泛存在于蚊 虫钠通道基因上,是蚊虫钠通道蛋白多样性的一个主要原因。关于这些可变剪接 子的可能生物学意义还需要进一步研究。 3.R一lab株抗性相关基因的研究 利用SSH技术成功建立了基于R一lab株的正向消减基因片段库和基于S一lab 株的反向消减片段库。从正向消减基因片段库任意挑选160个克隆送去测序,获 得了134个有意义克隆,序列长度在177一6O0bp之间。采用生物信息学方法将它 们分为三类,1)是有功能线索的基因:31个,其中8个对应于己知的白纹伊蚊 基因(同源性goryo),21个对应于其它已知蚊虫的基因如埃及伊蚊,冈比亚按蚊; 还有2个是对应于其它生物的基因;2)仅知其序列,而无功能线索(同源性在 40%一90%):16个;3)未知基因片段(在nr库中未找到任何同源性40%的基因 序列):S9个。通过已有文献对部分基因进行分析,选择两个最有可能与抗性相 关的基因(克隆号为1一18和1一11)进行进一步的研究。其中1一18是细胞色 素C氧化酶亚单位工,己有研究表明它在拟除虫菊酷抗性的德国小镰中高表达;1 一n是已知序列而功能未知的基因,在dBEST库中blast发现它与对氯菊醋抗性 的冈比亚按蚊cDNA文库中一条ESTs同源性高。采用实时荧光定量RT一PCR技术 对1一18和1一n两基因分析了它们在两品系中的表达差异。 本研究结果表明R一lab株的抗药性机理不是由个别基因所决定的,而是多个 基因参与的结果。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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