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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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特异性靶向IRES的抗丙型肝炎病毒核酸药物及影响IRES功能的因素研究

饶林  
【摘要】:丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种肝脏疾病,发病率和慢性化程度较高,严重威胁人类的健康,目前尚无有效的防治方法。HCV是一单股正链RNA病毒,病毒基因组全长9.4kb,由相对较长的5’非编码区,一个大的开放阅读框架以及较短的3’非编码区构成。HCV的蛋白翻译由5’NCR的内部核糖体进入位点(IRES)介导,其翻译类似于微小RNA病毒的内部起始机制。HCV的5’NCR位于HCV基因组的第1~341nt间,不同分离株长度不同,变异率最低,是所有HCV分离株中最保守的区域,高度有序,形成广泛稳定的二级结构,且含有帽非依赖性mRNA翻译所必须的内部核糖体进入位点(IRES)。HCV IRES作为HCV基因组中最保守的序列,在HCV感染的过程中是作为双功能分子存在的。一方面它以内部起始调控的方式介导其后的蛋白翻译,另一方面又可抑制PKR的活性。IRES作为HCV基因表达和复制的关键结构成为基因治疗的靶点。 RNA干扰(RNAi)是指在生物体内导入双链RNA后,引起体内同源基因特异性的沉默。两端各有两个突出碱基的小于25个碱基对的siRNA可在哺乳动物细胞中诱导RNAi的产生。脱氧核酶(DNAzymes)是一种具有催化作用的DNA分子,它是反义寡核苷酸的一种,人工合成,非生物体组成组分,分子量小,稳定性高,与RNA底物配对的精确性高,RNA分解酶活性强,不需胞内酶的参与。本研究的目的是以IRES作为HCV基因治疗的作用靶位,应用RNA干扰技术和脱 博士学位论文中文摘要 氧核酶技术进行抗丙型肝炎核酸药物研究。同时探讨了影响IRES功能的各种因素, 如IFN、酒精、PTB、La蛋白以及HCV的几种非结构蛋白等。 缺乏合适的HCV感染细胞及小动物模型,是目前抗HCV药物研究和开发的 主要障碍之一。因此构建一种HCV IRES介导荧光素酶基因表达的细胞及小动物 模型,可为以HCV IRES为靶标的反义寡核普酸、特异性核酶及siRNA等抗HCv 药物的评价及筛选创造条件。本实验所用HePG2.9706细胞株是HCV IRES介导荧 光素酶表达的转基因细胞模型。HCV IRES与荧光素酶基因融合,荧光素酶基因的 起始密码及调控序列均己切除,荧光素酶的翻译由HCV IRES介导启动。因此 HePG2.9706细胞中荧光素酶活性表达的高低,可反映HCV IRES基因的功能,易 于定量、简单易测。在此基础上进一步应用水动力转染法将表达质粒导入小鼠体 内,在小鼠肝脏可检测到高水平萤火虫荧光素酶的表达。从而初步建立了可以瞬 时评价靶向HCV IRES药物作用的细胞及小动物模型,为抗HCV反义药物研究奠 定了基础。 在实验中,我们选择了T7RNA聚合酶体外转录形成SIRNA和质粒表达ShRNA 两种方法。结果发现,两种方法合成的SIRNA均能有效地抑制HCV IRES的功能, 且均随剂量的增加,抑制作用增强。SIRNA具有很高的特异性,几个碱基甚至单 碱基的改变就可使其失效。两种方法合成的siRNA均表现出对靶mRNA,即HCV IRES的特异性抑制作用,而对EMCV IRES没有抑制作用。将合成的T7siRNA与 构建的荧光素酶报告基因同时注射到小鼠体内,发现特异地靶向HCV IRES的 siRNA对由HCV IRES介导荧光素酶的表达有明显的抑制作用。 脱氧核酶(Dz)是一种具有催化作用的DNA分子。不同催化活性的脱氧核酶 具有不同的结构,但基本上都由位于中间的催化活性部位和两侧的底物结合臂组 成。底物序列改变,只要酶的底物结合臂以互补的形式改变,并不影响酶的活性。 本研究选用了含10一23基序的Dz10一23结构。它的底物结合臂与底物间的作用是 完全通过标准的Watson一Crick配对。改变底物识别结构域的序列,Dz便能识别不 同的RNA底物。针对HCV IRES设计合成了5条Dz,评价其对目的基因的抑制 作用效果。结果显示特异性靶向HCV IRES的Dz,对靶基因有很好的抑制作用, 能够有效地阻断目的基因IRES介导的荧光素酶的翻译,抑制率可达50%。改变 02与靶基因结合的两侧的臂长,可以看出臂越短,抑制效果越强。 博十学位论文中文摘要 目前,干扰素是国际上唯一公认的治疗丙型肝炎的药物。但IFN抗HCV作用 机制并不完全清楚。本研究探讨了IFN对帽子依赖的翻译机制和HCV IRES介导 的内部起始翻译机制的抑制效果。研究结果显示IFN对这两种翻译机制均有抑制 作用,表明IFN对HCV IRES介导的内部起始翻译机制的抑制作用可能是也IFN 抗HCV作用的机制之一。 酒精在Hcv RNA的表达中起着明显的促进作用。我们在转染了pHcv Fluc 质粒的HePGZ细胞培养基中加入一定浓度的酒精,检测酒精对由Hcvl贬s介导 荧光素酶的作用。根据实验结果,当培养基中酒精浓度为10~ol/L时,细胞中IRES 介导荧光素酶的表达水平即有明显提高,当培养基中酒精浓度达到100mmol/L时, IRES的功能可达对照组的2倍以上。表明酒精能够明显促进HCV IRES介导的蛋 白翻译。 在HCV感染宿主时,宿主蛋白(PTB、La)对IRES的功能有很明显的作用。 这些蛋白分子可通过与IRES结合或蛋白一蛋白相互作用来影响IRES的功能。结果 显示,siRNA抑制了PTB和La蛋白的表达之后,IRES介导荧光素酶表达的功能 也明显下降。表明PTB和La蛋白对HCV IRES的功能具有明显的促进作用。 在HCV IRES发挥介导蛋白翻译的过程中,非
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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