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转录因子CTCF的功能研究

何莉  
【摘要】:CTCF(CCCTC-binding factor,CCCTC结合因子)是广泛存在于真核生物的 多功能转录因子。其M段11个锌指结构可以形成不同的组合,使CTCF调控多种 靶基因的表达。目前已发现它可以抑制c-myc基因的表达,增强app基因的启动子 活性,调控H19/Igf2的imprinting,作为鸡溶菌酶基因的沉默子成分,作为鸡β球 蛋白等多个基因结构域的绝缘子成份,以及作为X染色体失活的候选蛋白等,所 以CTCF在细胞生长与增殖、系统发生以及肿瘤发生等方面都有着重要的作用。 人们通过对这些单个基因的研究对CTCF的功能有了较广泛的认识,但CTCF是 细胞生长增殖和系统发生的调控网络的中心环节,它的变化会导致细胞内的一系 列改变。 本课题旨在利用小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制CTCF在 体细胞中的表达,进而研究CTCF改变所致调控网络的整体性变化,全面揭示CTCF 功能。目前国内外还没有类似的研究报道,国外仅有一篇利用长双链RNA干涉技 术在卵细胞中抑制CTCF表达从而影响H19基因imprinting的报道,与我们的研 究有很多不同,因此我们的研究具有一定的创新性。 本课题首先用RT-PCR.技术从人宫颈癌细胞系HeLa细胞总RNA中克隆了 CTCF全长cDNA,在大肠杆菌BL21(DE3) 中分段表达了CTCF蛋白N段和M段。 对CTCF蛋白N段进行了镍柱亲和纯化,得到的产物纯度大于80%:对CTCF蛋 白M段进行了在柱复性和变性镍柱亲和纯化研究。用纯化后的CTCF蛋白N段免 疫家兔,获得CTCF的多克隆抗体,进而用免疫印迹法亲和纯化抗体并用于细胞 内CTCF蛋白的检测,纯化后的抗体特异性大大提高。 本课题随后用两种siRNA干涉技术首次成功抑制了CTCF在体细胞中的表 达。先用体外转录的siRNA分别在293FT和HeLa细胞系中抑制CTCF的表达, 这些细胞系都表现出了CTCF mRNA和蛋白水平下降以及细胞生长抑制。其后用 核酸内切酶制备的siRNA(endoribonuclease-prepared siRNA,esiRNA)使CTCF基 因在HeLa细胞系中的表达被抑制70%以上,其mRNA和蛋白水平显著下降并表 现出强烈的细胞生长抑制。在上述两种研究中,CTCF mRNA下降幅度、蛋白下降 中文摘要 幅度与细胞生长抑制程度之间具有明显的相关性,提示CTCF正常表达对细胞生 长的重要性。 本课题还利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中证明:CTCF蛋白N段单 独作用对腺病毒晚期主要启动子的转录激活活性比完整蛋白强,CTCF的转录激活 结构域主要在该蛋白N段,而M段和C段几乎没有转录激活活性。 本课题为整体性地研究CTCF基因抑制后相关表达谱的改变提供了重要的实 验依据和必要的技术支持。


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