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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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人睫状神经营养因子的蛋白质工程研究

赵洪亮  
【摘要】:肥胖已成为全球性的一种慢性流行病,肥胖及其并发症已成为现代社会的沉重负担。减肥药物的研究与开发已成为各大制药公司优先考虑的一个重要目标。Leptin的发现揭示了体重控制的分子机制。但由于大多数患者都对leptin耐受,使得leptin不能成为一个有效的治疗肥胖症的药物。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一种天然的leptin的“模拟物”,可通过其特异性受体激发与leptin相似的信号转导通路,从而有效地绕过leptin耐受。动物实验和临床研究都显示了CNTF在治疗肥胖症上的良好的应用前景。Regeneron公司发明的hCNTF的三重突变体AX15已完成肥胖症的Ⅲ期临床实验,并取得了统计学上具有显著性差异的结果。但AX15分子的一些缺陷如易被蛋白酶降解,易聚合,较强的免疫原性和较短的半衰期等使其在成为药物上遇到了障碍。本研究拟针对上述缺陷对AX15进行改造。 通过N-端氨基酸测序确定了AX15在巴斯德毕赤酵母中表达时的降解位点,并利用定点突变技术构建了蛋白酶抗性突变体AX15(R13K)。AX15(R13K)的稳定性得到了显著的提高,在摇瓶中诱导120,小时后也未发生降解。虽然能被有效的分泌,AX15(R13K)在上清中以分子量为数十万以上的聚集体形式存在。6M盐酸胍可使AX15(R13K)聚集体解聚,利用Superdex75凝胶过滤层析可同时完成蛋白的复性和纯化。体外的TF-1存活实验和体内减肥实验都表明AX15(R13K)具有与AX15相当的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性,在临床应用上具有潜在的优势。 利用家族性DNA改组技术构建了人-大鼠嵌合CNTF分子文库。测序结果表明该文库具有很强的“偏性”。对该文库进行了3轮受体亲合力筛选,并随机挑取了5个克隆进行了DNA序列测定。在5个克隆中3个是AX15(R13K)亲本基因,有两个是嵌合分子,分别命名为CH1.1和CH1.4。CH1.1与AX15(R13K) 爹从 军事医学科学院博士学位论文人睫状神经营养因子的蛋白质工程研究 只有一个氨基酸的差异,并且具有相同的表达水平和活性。CHI.4与AX15(R13K) 有8个氨基酸的差异。虽然CHI .4的活性仅为Axls(R13K)的20%,但其表达 水平约为AX15(R13K)的2倍,提示CHI.4具有更高的翻译效率和/或稳定性。 将AX15中Q63R突变及DH一CNTF中的S166D/Q167H突变组合在一起,构建 了DH一AX15(R13K)突变体。体外和体内实验表明了DH一AX15(R13K)的活性约 是AX 15(R13K)的5倍。同时体内实验还发现DH一AX15(R13K)的作用比AX15 (R13K)更为持久。这种更为持久的作用可能是由其活性提高而非半衰期延长 引起的。高比活的hCNTF突变体一方面可以在保证疗效的前提下减少蛋白用量, 减少副反应;另一方面可以在不增加副反应的前提下增加最大耐受剂量,提高 疗效。 将HSA的C一末端和AX巧(R13K)的N一末端融合在一起,构建了融合蛋白 HSA一AX 15(R13K)。HSA一AX15(R13K)在巴斯德毕赤酵母中的表达水平比AX15 (R13K)提高了大约5倍,但在其连接处易发生降解。在连接处插入H个氨基 酸的接头并不能防止该降解,但却可以防止Axls(R13K)的聚合。与HSA融合 后不但增加了AX15(Rl 3K)的稳定性,而且延长了其半衰期:注射一次融合蛋 白可使小鼠的体重连续3天保持下降,而注射AX15(RI 3K)后小鼠体重在48小 时内开始反弹。长效人睫状神经营养突变体不但可以减少用药次数,提高病人 顺应性,而且可以减少血药浓度的波动,减少副反应。 在人CNTF分子表面由第44位L,第83位F,第85位V,第86位L,第98 位F,第151位L,第152位F,第156位L,第157位W和第159位L组成一 个主要疏水区域。为了用亲水性的糖链覆盖该区域,防止CNTF突变体由疏水作 用引起的聚合,在AX15(R13K)的第36,39,40,152,159位引入了糖基化位 点,构建了5个糖基化突变体。在5个突变体中N36一Ax15(R13K),N4O一AX15 (R13K),N159一AX15(R13K)等未能得到表达,N152一AX15(R13K)虽然能表达 但未发生糖基化,只有N39一AX15(R13K)在引入的糖基化位点发生了糖基化。 但超滤实验表明N39一AX巧(R13K)在上清中以分子量大于50kDa的聚集体存在, 糖基化并未防止AX巧(R13K)的聚集。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ464

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