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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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利用条件基因剔除技术研究Smad4基因在软骨内成骨过程中的功能

张继帅  
【摘要】:TGF-β超家族分子在调节细胞增殖、谱系分化、迁移、黏附和凋亡过程中具有 重要作用。Smad4分子是TGF-β超家族分子信号通路的中心介导者。为了进一步深 入研究TGF-β超家族分子在软骨内成骨过程中的功能,我们利用Cre-loxP系统研制 了软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。 我们首先利用ROSA26报告基因小鼠研究了软骨细胞特异性Cre转基因小鼠中 Cre重组酶表达的组织特异性。结果显示,在间充质细胞分化为软骨细胞时,便开 始表达Cre重组酶;Cre重组酶表达于脊椎骨、肋骨、四肢骨等所有由软骨内成骨 形成的骨骼软骨组织部位;胫骨切片可以看到Cre重组酶表达于所有软骨细胞。这 些结果表明Cre转基因小鼠能够在软骨细胞特异性表达Cre重组酶,可以作为在软 骨细胞进行基因剔除的工具小鼠。 通过将软骨细胞特异性Cre转基因小鼠和Smad4条件基因打靶小鼠交配,可以 得到在软骨细胞特异性剔除Smad4基因的小鼠。我们使用了我们建立的不同软骨细 胞特异性Cre转基因小鼠,发现产生的软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的表型 不同,分别表现为:胚胎期死亡、新生期死亡和出生后存活。利用剖宫产术观察新 生期死亡小鼠的死亡原因,发现死亡的基因剔除小鼠气管软骨环狭窄,肺不张,表 明小鼠死亡的原因主要是Smad4基因剔除后,气管软骨环狭窄,气体不能通过,致 使肺泡不能扩张,因为缺氧而死亡。 我们主要分析了出生后存活的软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的表型,揭 示了Smad4分子介导的BMP和TGF-β信号在软骨内成骨过程中的功能。Smad4基 因剔除小鼠体型矮小,骨骼骨化延迟。从出生后第四天开始,基因剔除小鼠的胫骨 生长板组织结构紊乱,表现为软骨细胞静止区增宽,增殖区和肥大区缩窄,软骨细 胞提前肥大分化。利用Brdu掺入法测量出生后4天小鼠软骨细胞的增殖程度,发 现基因剔除小鼠中增殖区软骨细胞的增殖能力降低。出生16人、22天后基因剔除 小鼠胫骨生长板部位的软骨细胞排列极度紊乱,骨髓腔内残留有片状的静止软骨细 胞。利用原位杂交检测生长板各区软骨细胞的标志分子,发现在软骨细胞增殖区有 一些细胞表达胶原X分子,表明增殖软骨细胞的肥大分化提前。这些结果表明Smad4 摘要 分子可以促进静止软骨细胞分化,刺激增殖软骨细胞增殖,抑制软骨细胞肥大分化, 并提示Smad4介导的信号可能作为调控生长板软骨细胞极性排列的形态发生素维持 生长板软骨的正常组织结构。 我们还研究了阻断Smad4介导的BMP、TGF一p信号对其它调控骨骼发育过程的 关键信号通路的影响。原位杂交和免疫组化结果显示,Smad4基因剔除导致Ihh、 Ptc、PTHrP、PPR基因的表达显著降低,提示基因剔除小鼠中Jh川PTHrP信号通路 的功能减弱。研究还发现Smad4基因剔除导致了FGF信号的功能相对增强,生长板 软骨细胞pZI分子表达水平升高以及STAT一1分子主要位于细胞核内。利用 Von一Kossa染色观察小鼠骨骼矿化情况,发现基因剔除小鼠的骨领位置较高,紧邻 增殖区软骨细胞。原位杂交检测成骨细胞的标志分子骨桥素和骨钙素,发现它们的 表达位置比它们在对照小鼠的表达位置升高。这些结果表明基因剔除小鼠中软骨膜 细胞提前分化为成骨细胞。为了验证Smad4介导的信号是否直接通过调节Ih树PTHrP 信号通路控制软骨细胞的肥大分化,我们进行了胚胎期拓骨体外培养实验。结果显 示Smad4基因剔除的踢骨失去了对BMP和TGF一p信号的反应,但仍能应答Ihh替 代分子Shh的作用,对照和基因剔除踌骨软骨细胞的肥大分化均受到Shh的明显抑 制。这些结果表明基因剔除小鼠中th讨PTHrP信号通路的功能正常,Smad4抑制软 骨细胞肥大分化的作用不依赖于thll/PTHrP信号通路。 我们的实验结果首次提供体内的遗传学证据证明Smad4分子是维持生长板软骨 正常组织结构所必需的。Smed4介导的信号促进静止软骨细胞分化,刺激增殖软骨 细胞增殖,不依赖于Ih可PTHrP信号通路抑制软骨细胞肥大分化。软骨组织特异性 Smad4基因剔除小鼠的成功研制为进一步深入研究smad4介导的TGF一p信号在软骨 内成骨过程中的作用和机制奠定了基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q344

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