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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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犬瘟热病毒F、H和N基因的克隆和表达

乌仁高娃  
【摘要】:犬瘟热病是由犬瘟热病毒(CDV)感染犬和其他食肉动物的多发性、致死性传染病。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属,为有囊膜的负链线性RNA病毒,基因组长约16kb。基因组中包括6个非重叠基因区。它们的编码基因按3′~5′端顺序依次为N-P-M-F-H-L系列。最新研究表明CDV融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原,是产生中和抗体的重要抗原之一。核衣壳(N)蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白,此外N蛋白上含有T细胞表位。H,F和N蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用。 本研究旨在获得CDV的N,F和H蛋白基因,将其克隆后在大肠杆菌中表达,获得大量易于纯化的N,F和H蛋白并对其功能进行研究,为研制基因工程疫苗和诊断试剂等打下理论基础。 一、CDV N基因保守区序列(NC)的克隆及表达:从犬瘟热病毒Onderstepoort株中提取病毒RNA,经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得犬瘟热病毒全长N基因,然后应用2对引物扩增获得2段CDV编码N蛋白保守区基因(NC1和NC2),将此片段克隆到质粒pGEM-Teasy测序,测序结果显示NC1和NC2与CDV Onderstepoort株DNA和推导的氨基酸同源性分别为99.7%、99.3%和100%、100%,利用谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-5x-3和麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达载体pMAl-C2构建了重组表达载体pGEX-5x-3-NC2和pMAl-C2-NC1,重组表达质粒经PCR和酶切鉴定后,将其分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)plys中和DH5α细胞中,经IPTG诱导,pGEX-5x-3-NC2没有获得目的蛋白表达,而pMAl-C2-Nc1成功获得了目的蛋白表达。 二、CDV H基因的克隆及表达尝试:应用一对引物,经RT-PCR扩增获得CDV全长H基因,将此片段克隆到pGEM-Teasy测序,测序结果显示与CDV Onderstepoort株DNA同源性为98.8%,所编码的氨基酸同源性为98.2%。然后利用6×His标记的重组表达载体pQE-32构建了重组原核表达载体pQE-32-H,重组表达质粒经PCR和酶切鉴定后,转化到大肠杆菌M15中,经IPTG诱导,没有获得目的蛋白的表达。 三、CDV F基因的克隆和表达:应用一对引物,经RT-PCR扩增获得CDV全长F基因,以全长F基因为模板应用4对引物,通过重叠PCR(OE-PCR)扩增获得缺失疏水区的F基因(dF)。将此片段克隆到质粒pGEM-Teasy测序,测序结果显示,与CDVOnderstepoort株DNA同源性为99.2%,所编码的氨基酸同源性为98.4%。将此片段插入 中文摘要 到pQE一30质粒构建了重组pQE一30一dF原核表达质粒,重组表达质粒经PCR和酶切鉴定 后,转化到大肠杆菌M巧细胞中,经IPTG诱导,获得了目的基因的高效表达,经聚丙 烯酞胺凝胶电泳和W己stem一印迹试验,验证其表达的重组蛋白产物分子质量大小为预期 的47000。将表达产物用Ni一NTA琼脂糖进行纯化,获得较高纯度的目的蛋白,目的蛋 白进行复性后免疫小鼠,所得的抗血清与CDV感染的Vero细胞在免疫荧光试验(IFA) 中,呈细胞阳性染色。 四、CDVF蛋白的应用:以重组表达的F蛋白作为包被抗原,初步建立了检测犬瘟 热血清抗体的间接ELIsA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125n留孔,血清 最佳稀释度为1:160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好, 可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
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1 冯佩平;犬瘟热病毒主要结构蛋白基因在昆虫细胞中的表达及间接ELISA检测方法的建立[D];吉林农业大学;2012年
【共引文献】
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4 杨彬;兰喜;殷相平;李学瑞;李宝玉;方玉萍;柳纪省;;口蹄疫病毒双效疫苗载体的构建及其体外表达研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
5 杨彬;兰喜;殷相平;李学瑞;李宝玉;方玉萍;柳纪省;;口蹄疫病毒双效疫苗载体的构建及其体外表达研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
6 孟宪荣;周蕾蕾;栗绍文;周祖涛;毕丁仁;陈辉;齐冰玉;;猪骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ基因的表达及其单克隆抗体的制备[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(上册)[C];2009年
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8 马丽敏;左静;雷连成;王玉平;;藏獒源犬瘟热病毒的分离鉴定及临床病理变化[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
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5 王桂琴;核心蛋白聚糖DECORIN在肝纤维化形成机制中的作用[D];第二军医大学;2000年
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7 冯晓勤;基因重组 人FasAD多肽的研制及其对移植物抗宿主反应的免疫抑制效应初探[D];第一军医大学;2000年
8 傅启高;绍兴鸭优良产蛋性能的内分泌及分子生物学机制研究[D];南京农业大学;2000年
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8 郭金金;重组人肾素受体的表达、复性及同时纯化研究[D];西北大学;2011年
9 李争明;激光光镊拉曼系统中高葡萄糖对NIT-1细胞凋亡影响的研究[D];广西医科大学;2011年
10 王敏;内源性硫化氢对柯萨奇病毒B_3性心肌炎小鼠心肌内病毒复制的影响[D];广西医科大学;2011年
【同被引文献】
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4 高炳淼;李宝珠;于津鹏;胡远艳;长孙东亭;罗素兰;;外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达[J];中国生物工程杂志;2011年11期
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8 莫小见,郭爱珍,陆承平;犬瘟热病毒南京株 H 蛋白基因的克隆与表达[J];中国病毒学;2004年05期
9 李颖;孙兴鲁;浦冠勤;;昆虫杆状病毒杀虫剂的研究进展[J];中国蚕业;2010年04期
10 简中友;贾赟;王全凯;徐立秋;胡传伟;李叶;李振荣;;检测犬瘟热病毒抗体的重组N蛋白-ELISA方法的建立及应用[J];中国预防兽医学报;2008年08期
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3 吕品;狐源CDV H、F、N基因序列分析及其TaqMan荧光定量RT-PCR诊断方法的建立[D];山东农业大学;2008年
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