收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

原代大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后动态变化的蛋白质学初步研究

潘刚  
【摘要】:星形胶质细胞是CNS内的主要胶质细胞,也是CNS损伤后出现反应最早的细胞之一,虽然近几年对星形胶质细胞在CNS损伤出现的变化反应及其机制进行了广泛深入的研究,但对其在脊髓损伤修复中的分子机制仍不清楚。因而研究星形胶质细胞在脊髓损伤修复中的作用,将有助于阐明SCI的分子机制。 本研究通过建立星形胶质细胞损伤模型,利用双向电泳技术获取星形胶质细胞损伤后差异表达蛋白,探求损伤后星形胶质细胞的一系列应答反应及蛋白水平上的动态变化。 我们采用原代脊髓胶质细胞进行研究以模拟脊髓损伤时胶质细胞蛋白质组学的变化。新生的Wistar大鼠,分离脊髓,剥除脊膜,取出脊髓至解剖液,然后用剪刀剪碎,再用胰酶消化,轻轻吹打后吹散脊髓组织,差度离心法富集胶质细胞。然后进行全脊髓混合培养,混合培养至第12天后通过机械振摇、玻璃培养瓶反复贴壁及调整接种密度等方法去除其它细胞,得到较纯的星形胶质细胞。我们采用GFAP免疫荧光方法标记胶质细胞,通过记数,检查培养纯度。结果显示培养的胶质细胞纯度达97%以上。继续培养至第24天,生长状态良好,几乎铺满皿底,形成大致均一的扁平细胞层,并具有短而粗大的突起。将此时处于比较稳定状态的星形胶质细胞,用于损伤实验。 为了研究星形胶质细胞在脊髓损伤修复中的作用,需要建立能再现损伤和再生过程的实验模型。利用星形胶质细胞具有突起的特点,我们设计了一种易操作、可控制、有较好重复性的损伤标准模板。将带有培养细胞的培养皿置于模板上,直视下沿着模板上的线条以锐器进行切割损伤,使损伤程度基本保持一致,提高了实验的重复性。损伤后在低倍显微镜下可见到网格状损伤。在损伤路径处胶质 军事医学科学院硕士学位论文 细胞完全切断,细胞死亡,损伤后部分细胞形态发生了改变,光镜下观察到部分 细胞的突起变得细长,细胞碎片明显增多。收集同批次培养的未损伤及损伤后24 小时、78小时、120小时四个实验组的星形胶质细胞,分别提取蛋白质,用于双 向电泳的样品制备。 蛋白质样品制备是进行蛋白质组学研究的关键。我们先采用超声破碎方法破 碎细胞,然后用细胞裂解液(7M尿素,ZM硫脉,4%w/v CHAPS,l%w/vDTT, 0.5%两性电解质和蛋白酶抑制剂混合物)提取蛋白。低温高速离心40分钟后, 弃沉淀,保留上清备用。提取的蛋白样品采用Bradford法进行定量,取等量的蛋 白质样品用于双向电泳。为了提高组内和各组间可比性,每个实验组的样品至少 重复三次,共得到12张ZDE胶 在进行IPG等电聚焦时,我们最终确定30,0 00Vhr作为控制一向的条件。在 SDS一队GE凝胶电泳时采用了优化后的凝胶配制方法,同时在电泳时采用固定胶条 位置的方法,提高了实验的重复性。在本研究的染色程序中,所有染色时间均控 制在4分钟以内。 在星形胶质细胞的双向电泳图谱中,70%以上的蛋白集中分布在MW 30一69kDa的范围内;约有60%左右的蛋白集中分布在PI3 .0一6.4的范围内。同时也 可看到脊髓星形胶质细胞在损伤后的不同时间其蛋白表达表现出了差异,其中在 损伤后的图谱中有一定的相似性。 对照组平均检测到1785个蛋白点,损伤后24小时实验组平均检测到1806个 蛋白点,损伤后72小时实验组平均检测到1809个蛋白点,损伤后120小时实验 组平均检测到1 841个蛋白点。以72小时实验组为例,组内匹配率达到了88%。 每个实验组首先进行组间匹配,不能匹配的蛋白点视为可能的差异蛋白点, 需进一步进行组内的匹配后进行确证,变化的蛋白点只有在组内匹配的才被视为 差异蛋白点。 在损伤不同时间出现动态变化的蛋白点共分析检测到50个,主要有三种变化 类型:一是损伤后某一时间出现而在其它时相不出现的蛋白点共有巧个,其中24 小时实验组出现而在其他实验组未出现的差异蛋白点,共有4个;损伤后120小 时实验组出现而在其他实验组未出现的差异蛋白点,共11个;二是损伤后某一时 间未出现而在其它时相均出现的蛋白点共有6个,其中在72小时实验组消失而在 军事医学科学院硕士学位论文 其他实验组均出现的差异蛋白点,共有4个,损伤后120小时实验组消失而在其 他实验组均出现的差异蛋白点,有2个;三是损伤后24小时实验组表达上调,在 损伤后72小时实验组表达下调,在损伤后120小时实验组表达上调的差异蛋白点, 共有7个,另有损伤后24、72、120小时表达均出现上调的蛋白18个,表达均下 调的蛋白4个。 质谱鉴定后的蛋白可大致分为四类:l)代谢类,如NAn一dependent Isoeitrate Dehydrogenase(NAD一IDH)和Dimet坷larginine Dimethylaminohydrolase 1(D DAHI),NAD一IDH主要参与三梭酸循环而DDAHI可能参与了神经系统的发 育过程;2)细胞骨架及细胞内蛋白转运类,如Vimentin和Beta一aetin,Vimentin 可能在脑胶质瘫痕的形成中起重要作用而Beta一actin则参与生长锥的运动过程并对 哺乳动物中枢内树突棘的兴奋性突触具有动态调节作用;3)分子伴侣类,如 prohibitin和Heatshoek 27 kDa Protein(HSP27),Prohibitin可能对细胞的生存起 着重要的调节作用,而胶质细胞内HSP27的表达升高被认为可以阻止细胞死


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王颖,邱建勇,段丽,陈良为,饶志仁;胃伤害性刺激诱导大鼠脑干星形胶质细胞GFAP蛋白表达及其与神经元的关系[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2001年02期
2 陈玉敏;陈涛平;;星形胶质细胞的研究进展[J];现代中西医结合杂志;2008年28期
3 ;星形腹质细胞[J];解剖学研究;1990年01期
4 朱发明,文志斌,何晓凡,李俊成,贺石林;大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其调控[J];生理学报;1999年03期
5 曹海燕,张月华,梁卫兰,姜玉武,吴希如;高钾和(或)谷氨酸对培养的星形胶质细胞Connexin43表达的影响[J];中国神经科学杂志;2001年04期
6 张成;吴建云;张家骅;;星形胶质细胞的研究进展[J];中国动物保健;2011年05期
7 肖芷江,杨品华,唐小海,廖明波;GFAP标记人胎视网膜星形胶质细胞的观察[J];四川解剖学杂志;1997年02期
8 何宇,谢学军;星形胶质细胞与血-视网膜屏障[J];中国中医眼科杂志;2005年02期
9 阮林,刘仁刚,周洁萍;IL-1β对星形胶质细胞的激活作用[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2005年04期
10 骆翔;喻志源;冯永东;王伟;;缺血缺氧对体外培养星形胶质细胞细胞活化和细胞周期的影响[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2006年05期
11 ;星形胶质细胞通过溶酶体释放信号分子ATP[J];科学通报;2007年16期
12 徐琴;赵正言;;甲状腺激素对脑发育期星形胶质细胞的影响[J];中国妇幼健康研究;2008年05期
13 沈维高;何欣;王振江;;星形胶质细胞的生物学功能及其与疾病的关系研究进展[J];北华大学学报(自然科学版);2008年06期
14 王雅洁;星形胶质细胞GJ及Cx43表达影响因素研究进展[J];国外医学.儿科学分册;2001年03期
15 张宏伟,张亚卓,张海霞,陈晓光,王晓良,于春江;星形胶质细胞诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化前后的电生理功能鉴定[J];中华神经医学杂志;2004年05期
16 陈青;刘传勇;;星形胶质细胞的活化机制及功能研究[J];泰山医学院学报;2006年01期
17 余涛;刘秋菊;金璐;文铁桥;;星形胶质细胞低温去分化条件[J];上海大学学报(自然科学版);2006年06期
18 李宝华;蒋正刚;徐林;李康;熊思东;;CVB3感染对星形胶质细胞表达agrin的影响及意义[J];复旦学报(医学版);2007年05期
19 胡沙;;星形胶质细胞生物学功能研究进展[J];淮南职业技术学院学报;2010年01期
20 何丹;喻志源;王伟;;VRAC通道与脑内兴奋性氨基酸释放的研究进展[J];神经损伤与功能重建;2010年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐剑文;王玮;康仲涵;张更;周琳瑛;;低氧对小鼠星形胶质细胞超微结构的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
2 魏为;;星形胶质细胞与视网膜盘状瘢痕[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年
3 周晓燕;邬力祥;刘发益;曹莉;;大鼠脑星形胶质细胞的培养方法[A];湖南省生理科学会新世纪学术年会论文摘要汇编[C];2002年
4 白龙梅;李学忠;杨亚萍;曹碧茵;刘春风;;脂多糖可调节星形胶质细胞Toll样受体表达,对细胞增殖具有双重性[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
5 武明明;孙晓川;;APOE多态性与星形胶质细胞创伤后兴奋性氨基酸的相关性研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年
6 韩钊;田继沙;张红霞;;2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉对星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的保护及脂质过氧化作用[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
7 黄建敏;黄瑞雅;李雪斌;唐雄林;吴小飞;;辛醇对红藻氨酸致痫大鼠的癫痫敏感性及GFAP免疫活性的影响[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
8 邓平;;星形胶质细胞及其标志蛋白GFAP在脑损伤时间推断中的研究进展[A];第五次全国法医学术交流会论文集[C];1996年
9 熊加祥;黎海蒂;李希成;;吗啡对大鼠海马星形胶质细胞[Ca~(2+)]i的影响[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
10 王珍;刘仁刚;周洁萍;刘云华;;地塞米松对大鼠大脑皮质星形胶质细胞的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 冉建华;AQP9在脑水肿形成中的作用及其表达调控[D];重庆医科大学;2005年
2 王昭金;大脑不同部位对同种异体甲状旁腺移植的影响[D];中国协和医科大学;1996年
3 孙涛;脊髓星形胶质细胞参与神经病理性疼痛调制的实验研究[D];华中科技大学;2007年
4 李建华;TRPC3在脂多糖诱导星形胶质细胞活化中作用[D];南方医科大学;2010年
5 张巍;小胶质细胞和星形胶质细胞在多巴胺能神经元变性和保护中的可塑性变化[D];大连医科大学;2004年
6 李爱群;阿朴吗啡促进多巴胺能神经元存活的机理研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2006年
7 杜亦旭;脑缺血后突触重建与星形胶质细胞相关性及针刺干预作用研究[D];广州中医药大学;2008年
8 杨美;AQPs在脑水肿形成中的作用及其表达调控[D];重庆医科大学;2008年
9 吕兰海;过氧化氢、Aβ(1-42)和Tau蛋白对两原代培养星形胶质细胞的效应对比研究[D];浙江大学;2007年
10 王静雯;腺苷A_1受体在脑神经元低氧复氧损伤中的保护作用及机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 何滔;大鼠皮质原代星形胶质细胞液压冲击损伤前后蛋白质组学研究[D];河北医科大学;2007年
2 潘刚;原代大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后动态变化的蛋白质学初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 孙燕;O-2A祖细胞分化和两型星形胶质细胞抗原表达差异的研究[D];苏州大学;2003年
4 张允;锂-匹罗卡品癫痫大鼠小脑中胶质细胞反应性观察及银杏叶提取物干预研究[D];大连医科大学;2005年
5 颜晓慧;缺氧对大鼠星形胶质细胞AQP4表达的影响[D];第一军医大学;2005年
6 万明辉;星形胶质细胞基因表达谱差异及其对损伤反应的研究[D];苏州大学;2004年
7 杨晓文;模拟高原环境大脑皮质及血脑屏障的病理变化与AQP4的相关性实验研究[D];第三军医大学;2005年
8 颜因;大鼠局灶脑缺血/再灌注后星形胶质细胞的反应及星形胶质细胞炎症介质的表达[D];重庆医科大学;2007年
9 张媛;飞秒脉冲激光诱导的星形胶质细胞钙波[D];华中科技大学;2007年
10 林佳;柴胡皂苷a对谷氨酸激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞的干预作用[D];南方医科大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘霞;脑内星形胶质细胞在实验室培育成功[N];科技日报;2011年
2 胡德荣;胶质细胞溶酶体具有分泌ATP的功能[N];中国医药报;2007年
3 记者 刘海英;星形胶质细胞可调节呼吸强度[N];科技日报;2010年
4 吴一福;黄芪可调节星形胶质细胞“时间模式”[N];中国医药报;2005年
5 潇潇;胶质细胞有望成“候补”[N];大众科技报;2007年
6 实习记者 王远白;八年真爱救活绝症妻子[N];贵阳日报;2010年
7 要粮安 黄福彩 詹春艳;晋中投运线路视频差异分析监控系统[N];国家电网报;2010年
8 梦鹿;使用特殊调节蛋白脑细胞可再生[N];医药经济报;2007年
9 时延学 赵秋杰;重视个案税负差异分析[N];中国税务报;2006年
10 刘霞;德科学家找到使脑细胞再生的方法[N];科技日报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978