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《中国人民解放军军事医学科学院》 2004年
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低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响

赵惠卿  
【摘要】:氧是生命存在的必要条件,是机体新陈代谢和维持生存的重要因素之一,而低氧是生命发育的基本环境。在妊娠的早期,由于没有血管的形成,所以胚胎是在低氧环境中发育的。低氧作为一种生理性的刺激因素,影响着胚胎的发生、发育及正常功能的维持。低氧可激活低氧诱导因子(HIF-1),从而调控一系列与缺氧相关基因的表达。例如,诱导与葡萄糖分解、转运、红细胞和血管再生等相关的基因,使其表达增加,从而维持体内氧环境的稳态。关于低氧作用的研究,目前多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面,而对低氧在细胞增殖、分化中影响的研究较少。特别是胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)体外培养和增殖分化作用的研究都是在常氧(20%O_2)条件下进行的,这样难以反映体内的真实情况。低氧在体内作为一种生理性的刺激因素,对体外培养的ES细胞增殖和分化的作用目前还不清楚,也没有引起科研人员的足够重视。因此,本文就低氧对ES细胞体外增殖和分化作用的影响进行了初步研究。 1.低氧对ES细胞体外增殖的作用 利用细胞记数法和BrdU(5-溴脱氧尿苷)掺入的流式细胞分析检 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响 测低氧对ES细胞的增殖作用,并用RT一PCR和western一B10t蛋白印迹 杂交的方法初步检测了ES细胞中低氧诱导因子一l(HIF一la)的表达 变化。结果显示:(l)将ES细胞分别放在低氧(3%02和10%仇)和常氧 (20%02)的环境中培养24小时后,在低氧环境中培养的ES细胞数较 常氧组明显减少。(2)将ES细胞分别给予间歇性低氧刺激(3% 02和 10%02),每天10分钟,连续4天后,发现3%低氧组较常氧对照组的 细胞增殖明显升高。(3)我们又进一步用RT一PCR方法观察HIF一IQ mRNA的表达与细胞增殖的关系,发现在常氧环境中培养的ES细胞即 有H工F一IQmRNA的表达,ES细胞在持续低氧24小时或间歇性低氧(3% 02和10%02)刺激4天后对HIF一la的表达均无明显影响。(4) western一Blot蛋白印迹杂交结果表明:持续低氧和间歇性低氧后,常 氧组与低氧组间HIF一IQ蛋白表达量无明显差异。 2.维甲酸(RA)诱导ES细胞向神经细胞方向分化的方法建立 常规培养的ES细胞,以3x105/ml的密度接种于细菌培养皿,在 含20%胎牛血清的分化培养基中即可自然分化形成拟胚体(Embryonic body,EB)。EB经RA的诱导向神经细胞方向分化。本研究中,我们 主要采用了自然分化的EB形成4天后,加入RA(终浓度为 5X10一7M) 诱导4天,即4d+4dRA诱导分化的方法,诱导结束后,收集EB,单细 胞接种于涂l%明胶的细胞培养皿中。然后换成无血清DMEM/F12高糖 培养基,同时添加终浓度为2%的NZ神经营养因子培养。结果显示:(l) 4d+4dRA方法可诱导出nestin阳性的神经前体细胞,且分化率达90% 以上。(2)4d+4dRA方法可诱导出较多NeuN免疫反应阳性的神经元样 细胞。 3.低氧对EB的形成及向神经前体细胞方向分化的影响 ES细胞常规培养液中撤除白血病抑制因子(LIF)和脱离饲养层 培养,即可自然分化为EB。我们选择5x104/ml接种ES细胞于细菌培 养皿,使之自然分化形成EB,并给予持续性低氧(3%02)4天后,EB 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响 形成较常氧组减少,且低氧组EB数随低氧培养时间的延长而逐渐降 低,即低氧组12天时形成的EB数少于8天时,低氧8天时则少于4 天时。 为了观察低氧对体外诱导ES细胞向神经前体细胞分化过程的影 响,我们用nestin标记流式细胞方法检测ES细胞向神经前体细胞的 分化情况。常规培养的ES细胞以3x105/ml密度接种于6Omm细菌培 养皿,培养4天形成EB,第五天开始分组,即RA组;低氧组;低氧 加RA诱导组。RA组:ES自然分化形成EB4天后,再加5 X10一,M RA 诱导4天;低氧组:ES自然分化形成EB4天后,再给予持续低氧条件 培养4天;低氧加RA诱导组:ES自然分化形成EB4天后,再同时给 予持续低氧条件和添加sxlo一7MRA诱导培养4天。流式细胞检测结果 表明低氧促进体外诱导ES细胞向神经前体细胞的分化,细胞免疫组化 结果进一步加以证实了此现象。 综上所述,低氧对ES细胞体外增殖和分化均有影响。就本实验而 言,持续性低氧抑制ES细胞的体外增殖,而间隙性低氧(3%02)可 促进ES细胞的体外增殖;持续性低氧或间歇性低氧后,ES细胞内 HIF一1 a mRNA表达都无明显变化;持续性低氧和间歇性低氧后,低氧 和常氧组间无明显差异;低氧(3%02)抑制ES细胞体外自然分化形 成EB;单纯低氧(3%02)抑制ES细胞体外分化为nestin染色阳性的 神经前体细胞;而低氧(3%02)并同时添加RA诱导分化组与单纯RA 诱导分化组比较,则促进其向nestin染色阳性神经前体细胞的分化。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q25

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